Unia brzeska z 1596 r., której celem było połączenie wschodniego i zachodniego chrześcijaństwa, stała się przyczyną napięć między prawosławnymi a katolikami. Do 1632 r. władze Rzeczypospolitej nie uznawały Kościoła prawosławnego i hierarchów prawosławnych poddawano naciskom, aby przeszli do Kościoła greckokatolickiego. Charakterystyczną formą nie tylko religijnego, ale politycznego sprzeciwu prawosławnej społeczności stały się bractwa, często tworzone przez cechy rzemieślnicze. Fundowały one szkoły i otwierały drukarnie.
Na mocy rozejmu andruszowskiego tereny Ukrainy na Wschód od Dniepru (lewobrzeże) zostały oderwane od Rzeczypospolitej, a na mocy umowy z Konstantynopolem z 1686 r. Kościół prawosławny na Ukrainie podporządkowany został Patriarchatowi Moskiewskiemu. Umowa ta pozwalała m.in. na interwencje Katarzyny II w kwestie wyznaniowe w Rzeczypospolitej.
Prawosławie w Hetmanacie Prawosławie było wyznaniem Hetmanatu, który powstał w wyniku powstania Chmielnickiego, podnoszącego także obronę prawosławia.
Szczególny okres w sztuce sakralnej, a także życia umysłowego związanego z prawosławiem przypada na okres hetmanatu Iwana Mazepy. W architekturze kościelnej szczególna odmiana stylu barokowego tej epoki nazywa się barokiem kozackim.