Użycie przeciwciał Membranę z białkami inkubuje się w roztworze odtłuszczonego mleka w proszku, kazeiny lub albuminy z surowicy wołowej. Substancje te rozpuszcza się w buforze stosowanym do przemywania membrany, który składa się z TBS lub PBS i niejonowego detergentu, na przykład Tween 20). Mieszanina ta to tak zwany bufor blokujący, który ostatecznie wybierany jest na drodze empirycznej. Dzięki niemu blokowana jest możliwość niespecyficznego wiązania się przeciwciał do membrany.
Następnie membranę inkubuje się z przeciwciałem związanym ze znacznikiem (metoda bezpośrednia) lub z dwoma rodzajami przeciwciał: nieznakowanym, specyficznym, rozpoznającym pożądane białko (przeciwciało pierwszorzędowe) oraz znakowanym, rozpoznającym przeciwciało pierwszorzędowe (przeciwciało drugorzędowe).