Przeciwciała drugorzędowe rozpoznają epitopy charakterystyczne dla przeciwciał gatunku, z którego pozyskano przeciwciała pierwszorzędowe. Przykładowo jeśli pierwszorzędowe przeciwciała pochodzą od myszy, przeciwciała drugorzędowe powinny pochodzić od innego zwierzęcia, np. kozy, i być skierowane przeciw przeciwciałom myszy. Taki dwustopniowy system detekcji pozwala oszczędzić czas i jest tańszy. Przeciwciała swoiste wobec konkretnego białka są bowiem unikalne, więc i kosztowne, a znakowanie we własnym zakresie pociąga za sobą straty. Roztwór do rozcieńczenia przeciwciała często jest taki sam jak bufor blokujący. Stosunek rozcieńczenia przeciwciała pierwszorzędowego ustalany jest eksperymentalnie.
Inkubacje te przeprowadza się na wytrząsarkach orbitalnych i po użyciu przeciwciał wymywa się te niespecyficznie związane odpowiednim buforem z detergentem. Zbyt intensywnie wymywanie może znacznie obniżać sygnał pochodzący od analizowanego białka; niewystarczające przemywanie może doprowadzić do uzyskania zbyt wysokiego tła.