Jesienią 1496 roku papież wysłał do szesnastu klasztorów italskich brewe, w którym zapowiedział utworzenie kongregacji toskańsko-rzymskiej, co miało odebrać władzę Savonaroli. Zwolennicy Girolamo sprzeciwili się i zapowiedzieli, że nie podporządkują się takiej decyzji. Aleksander VI postanowił tymczasowo wycofać swój wniosek. Dominikanin wzmocnił swoje kazania i jeszcze ostrzej atakował papieża i Kurię. Wobec tego, 13 maja 1497 roku Aleksander nałożył na niego ekskomunikę, zarzucając odmowę przybycia do Rzymu, głoszenie fałszywych doktryn i nieprzyłączenie konwentu św. Marka do prowincji toskańsko-rzymskiej. We Florencji ekskomunika ukazała się dopiero 18 czerwca, lecz Savonarola nie uznał jej ważności, powołując się na traktaty francuskiego teologa Jeana Gersona, który podczas soboru w Konstancji twierdził, że od ekskomuniki można odwołać się do soboru. Pod koniec czerwca wysłał do papieża list z kondolencjami z powodu śmierci jego syna Jana, zamieszczając w liście także ocenę niemoralności Aleksandra. Ponieważ pozycja dominikanina we Florencji zaczęła maleć, zaprzestał on głoszenia kazań i skupił się na pracy nad swoim magnum opus „Triumf krzyża” (). W październiku napisał kolejny list do papieża, zawierający chęć pojednania i prośbę o przebaczenie, jednak pozostał on bez odpowiedzi.