Karol z urodzenia i kultury czuł się Flamandem i otaczał się dworzanami ściągniętymi z Niderlandów, ponadto wkrótce zaangażował się w wielką politykę europejską, spychając interesy Hiszpanii na dalszy plan. Doprowadziło to wkrótce do otwartego buntu rozgoryczonych miast, części szlachty i chłopstwa, społeczeństwo czuło się bowiem wykorzystywane do finansowania dynastycznych planów monarchy. Było to tzw. powstanie Comuneros (1520). Powstańcy odbili Tordesillas i zaproponowali Joannie oddanie realnej władzy, jednak więziona przez lata królowa nie chciała bądź nie była w stanie przejąć realnych rządów. Według niektórych źródeł nie wiedziała nawet o śmierci swego ojca i nie chciała uwierzyć, że przeciw niej walczy jej własny syn. Gdy zwolennicy Karola pokonali powstańców i zajęli znów Tordesillas, Joanna znów trafiła do niewoli, w której miała spędzić resztę swego życia. Przeżyła swe rodzeństwo o kilkadziesiąt lat, a ostatnie 35 lat życia spędziła całkowicie odcięta od świata w przyklasztornych murach zamku w Tordesillas, gdzie czuwała przy zabalsamowanych zwłokach swojego męża. Zmarła w 1555 roku.