Przy czym Ferdynand nie miał żadnych skrupułów, by pozbawić ją władzy wbrew jej zdaniu. Joanna odmówiła podpisania dokumentu przekazującego władzę ojcu, był to jednak jej ostatni, bezsilny akt sprzeciwu. Ferdynand rozkazał uwięzić córkę w zamku przy klasztorze Santa Clara w Tordesillas, gdzie spoczywał jej ukochany mąż. W odosobnieniu jej psychika doznała dalszego rozchwiania, co prawdopodobnie doprowadziło u Joanny do schizofrenii. Sama Joanna nigdy nie została pozbawiona formalnie władzy i wszystkie akty urzędowe do końca jej długiego życia były wystawiane w jej imieniu, zarówno w Kastylii, jak i później w Aragonii i innych podległych jej koronach.
Zakładniczka ambicji syna Po śmierci Ferdynanda w 1516 Joanna stała się również nominalnie królową Aragonii, a zarazem pierwszą prawdziwą władczynią zjednoczonych królestw Hiszpanii. Jej położenie faktyczne niewiele się jednak zmieniło. Sprawujący regencję po śmierci Ferdynanda kardynał Cisneros wezwał najstarszego syna Joanny – Karola, by objął rządy w państwie. Karol, wychowany z dala od matki, w Niderlandach, był – podobnie jak jego dziadek – pozbawionym sentymentów politykiem. Po przybyciu do Hiszpanii spotkał się wprawdzie raz z matką, nie pozwolił jej jednak opuścić Tordesillas i uniemożliwił kontakty ze światem zewnętrznym. Władzę przejął formalnie w jej imieniu.