Melchior Stefanides (pierwszy rektor; logika, metafizyka, prawo), Wawrzyniec Starnigel, Adam Burski (filozof), Tomasz Drezner (prawnik), Jan Niedźwiecki-Ursinus (medyk i twórca podręcznika gramatyki łacińskiej „Methodicae grammaticae libri IV”), Maciej Jaworowski (prawo, filozofia), w późniejszym okresie także Stanisław Staszic. Wykłady odbywały się po grecku i łacińsku. Uczelnia ta, według ustaleń Jana Zamoyskiego, jej fundatora, była organizacyjnie połączona z ówczesną kolegiatą (dziś katedrą), nadzór nad nią posiadało duchowieństwo, co negatywnie wpłynęło na jej działalność. W 1600 ogłoszony został ostateczny akt fundacji akademii, opublikowano jej regulaminy wewnętrzne i program. W pierwszych latach działania Akademii Zamojskiej jej profesorami byli m.in. szkocki znawca prawa rzymskiego William Bruce, włoski teolog Dominik Convalis i belgijski matematyk Adriaan van Roomen. W założeniach kanclerza Zamoyskiego uczelnia miała być przeznaczona głównie dla szlachty, ale wbrew intencjom fundatora jej charakter zmienił się szybko ze szlacheckiego na mieszczański. W latach 1607–1609 młodzież pochodzenia szlacheckiego stanowiła zaledwie 5% spośród 237 przybyłych wówczas studentów, zaś najliczniejszą grupą studentów byli mieszczanie.