To właśnie w akcie fundacyjnym uczelni z 1600 zawarte zostały powszechnie znane słowa kanclerza Zamoyskiego: „Takie są rzeczypospolite, jakie ich młodzieży chowanie”. W planach kanclerza Akademia miała być prężnym ośrodkiem kultury polskiej i katolickiej, który oddziaływałby silnie na ludność prawosławną, przeważającą w województwach południowo-wschodnich. W pierwszej dekadzie swojego istnienia (do śmierci hetmana), Akademia zdobyła sobie znaczny rozgłos nie tylko w Polsce, ale także w całej Europie. Dzięki niej Zamość na przełomie XVI i XVII wieku był jednym z głównych ośrodków myśli naukowej w Polsce. Godność kanclerza Akademii Zamojskiej przysługiwała biskupowi chełmskiemu.
Okres jej świetności przypadał na przełom XVI i XVII wieku. Później stopniowo podupadała. Ostatecznie zlikwidowana w 1784, kiedy zamieniono ją w liceum.
Ważną rolę przy tworzeniu tej akademii odegrał także poeta Szymon Szymonowic, który sprowadził tu profesorów. Na początku działalności Akademii Zamojskiej istniały trzy wydziały: filozoficzny, medyczny, prawniczy. Zajęcia prowadziło 15 profesorów, m.in.