Палеогеномика ― научно поле засновано на реконструкција и анализа на геномските информации кај изумрените видови. Подобрените методи за екстракција на стара ДНК од музејски артефакти, ледени јадра, археолошки или палеонтолошки наоѓалишта и технологии за секвенционирање преку т.н. „следна генерација“ го поттикнале ова поле. Сега е можно да бидат забележани генетски поместувања, стари преселби на населението и меѓусебни односи, еволутивна историја на изумрени растенија, животински видови и видови од родот човек и идентификација на фенотипски одлики низ географските региони. Научниците исто така можат да користат палеогеномика за да ги споредат старите предци со современите луѓе.Lan T. and Lindqvist C. 2018. Paleogenomics: Genome-Scale Analysis of Ancient DNA and Population and Evolutionary Genomic Inferences. In: Population Genomics, Springer, Cham. pp 1-38. Зголемената важност на палеогеномиката е видлива од фактот дека Нобеловата награда за физиологија или медицина во 2022 година му била доделена на шведскиот генетичар Сванте Пебо [1955-], кој работел на палеогеномиката.
Заднина Првично, секвенционирањето на стара ДНК вклучувало клонирање на мали фрагменти во бактерии, што продолжило со ниска ефикасност поради оксидативното оштетување што старата ДНК го претрпела во текот на милениумите. Старата ДНК е тешко да биде анализирана поради лесно разградување од нуклеазите; специфичните средини и послесмртните услови ја подобриле изолацијата и анализата. За веродостојни анализи биле неопходни протоколи за екстракција и контаминација. Со развојот на полимеразната верижна реакција во 1983 година, научниците можеле да проучуваат примероци на ДНК стари до приближно 100.000 години, ограничување на релативно кратките изолирани фрагменти. Преку напредокот во изолацијата, засилувањето, секвенционирањето и реконструкцијата на податоците, постарите и постарите примероци станале анализирани. Во текот на изминатите 30 години, митохондриската ДНК со голем број копии можела да одговори на многу прашања. Доаѓањето на техниките со масивно напоредно секвенционирање поттикнало многу повеќе. Покрај тоа, оваа технолошка револуција овозможила премин од палеогенетика во палеогеномика.
Методи на секвенционирање
Предизвици и техники Полимеразната верижна реакција, масивното напоредно секвенционирање како втора генерација и различни библиотечни методи се достапни за секвенционирање на старата ДНК, покрај многуте биоинформатички алатки. Кога се работи со секој од овие методи, важно е да се земе предвид дека старата ДНК може да биде променета послесмртно. Специфичните измени произлегуваат од:
Податоци за секвенца на основни мутациски обрасци (C->T мутација) Вкрстени врски Деаминација на цитозин (зголемена кон крајот на читањето) Депуринација Фрагментација на геномот
Специфичните обрасци и почетокот на овие измени им помагаат на научниците да ја проценат возраста на примерокот.
Порано, научниците дијагностицирале послесмртни штети користејќи ензимски реакции или гасна хроматографија поврзана со масовна спектроскопија; во последниве години, научниците почнале да ги забележуваат со искористување на податоците од мутациската секвенца. Оваа стратегија овозможува да биде идентификуван вишокот на C->T мутации по третман со урацилна гликозилаза на ДНК. Во денешно време, е користено секвенционирање со висок пропусен опсег за да биде идентификувана депуринација (постапка што ја поттикнува послесмртната фрагментација на ДНК, помладите примероци содржат повеќе аденин отколку гванин), прекини на една врска во двојната спирала на ДНК и абазичната местоположба (создадена од C- >Т мутација).Еден фрагмент од старата ДНК може да биде секвенциониран во целосна должина со секвенционирањето со висок пропусен опсег. Со овие податоци можеме да биде создадено распространување што претставува крива на распаѓање на големината што овозможува директна квантитативна споредба на фрагментацијата низ примероците низ просторот и условите на животната средина. Низ целата крива на распаѓање е можно да се добие средната должина на дадениот фрагмент од стара ДНК. Оваа должина ги одразува нивоата на фрагментација по смртта, што претежно се зголемува со температурата на таложење.Orlando L., Gilbert MT., Willerslev E. 2015. Reconstructing ancient genomes and epigenomes. Nat. Rev. Genet. 16(7):395-408.
Библиотеки Може да се изведат две различни библиотеки за секвенционирање на стара ДНК со помош на полимеразната верижна реакција за засилување на геномот:
Библиотека на двоверижна стара ДНК Библиотека на едноверижна стара ДНК
Првиот е создаден со помош на пристапот со тапи краеви. Оваа техника користи два различни прилагодувачи: овие прилагодувачи случајно го врзуваат фрагментот и тој потоа може да се засили. Фрагментот што не ги содржи двата прилагодувачи не може да се засили предизвикувајќи извор на грешка. За да биде намалена оваа грешка, била воведена Illumina T/A лигатурата: овој метод се состои во вметнување на опашката A во примерокот на ДНК за да биде олеснето врзувањето на прилагодувачите со T опашка. Во овие методи го оптимизираме засилувањето на стара ДНК.
За да бидат добиени библиотеки на едноверижна ДНК, ДНК прво е денатурирана со топлина. Добиената едноверижна ДНК потоа е врзувана на два прилагодувачи со цел да биде создадена комплементарната низа и на крајот е применувана полимеразна верижна реакција.
Збогатување на стара ДНК Бидејќи старата ДНК може да содржи бактериска ДНК или други микроорганизми, постапката бара збогатување. За да бидат одделени ендогени и егзогени фракции, користени се различни методи:
Збогатување на оштетен шаблон: користено е при конструирање на библиотека на едноверижна ДНК бидејќи овој метод цели на оштетување на ДНК. Кога Bst полимеразата го исполнува пределот, примерокот е третиран со урацилна ДНК гликозилаза и ендонуклеаза VIII. Овие соединенија го напаѓаат абазичното место. Неоштетената ДНК останува прикачена на парамагнетни зрнца обложени со стрептавидин и може да биде одвоена од примерокот. Овој метод е специфичен за примероци од неандерталците од доцниот плеистоцен. Збогатување на целта во раствор без екстензии: овој метод е заснован на хибридизација со цел-сонда. Овој метод бара денатурација на ДНК и потоа вметнува преклопувачки плочки сонди долж целните региони. Потоа, користена е полимеразна верижна реакција за амплификација на ДНК и на крајот ДНК е поврзувана со биотинилиран прилагодувач. Тоа е корисно за примероци од архаичното потекло на хомининот. Збогатување на целта во цврста фаза: во овој метод напоредно со надледување за секвенционирање со „сачмарка“ се користени микросреди и методот на полимеразна верижна реакција во вистинско време. Збогатување на целиот геном: користено е за секвенционирање на целиот геном на поединечни поединки. Користено е за заробување во раствор со цел геном. Овој метод започнува со подготовка на библиотека со сонда на РНК ширум геномот од вид со геном кој е тесно поврзан со целниот геном во примерокот на ДНК.
Диверзификација на денешното неафриканско население и анатомско современите луѓе Досега многу студии во различни области довеле до заклучок дека денешното неафриканско население е резултат на диверзификацијата во неколку различни лози на предците, добро структурирани, метанаселенија кои биле во главна улога во проширувањето надвор од Африка, кои носеле африканско генетско наследство. Во овој контекст, анализата на старата ДНК била фундаментална за тестирање на веќе формулираната хипотеза и за давање нови сознанија. Прво, тоа овозможи да биде стеснето времето и структурата на овој феномен на диверзификација преку обезбедување на калибрација на стапката на автосомна и митохондриска мутација.Skoglund P. and Mathieson I. 2018. Ancient genomics of modern humans: the first decade. Annu. Rev. Genom. Hum. Genet. 19:1, 381-404. Анализата на мешавини покажала дека се случиле најмалку два независни настани на проток на гени помеѓу предците на современите луѓе и архаичните луѓе, како што се групите на население на неандерталците и денисовците, што сведочат за моделот на „протечена замена“ на историјата на евроазиското човечко население. Според сите овие податоци, човечката дивергенција на неафриканските лози се случила околу 45.000 – 55.000 пред сегашноста. Освен тоа, во многу случаи, старата ДНК дозволила да бидат следени историските постапки кои со текот на времето довеле до вистинската генетска структура на населението, што би било тешко да биде направено сметајќи само на анализата на денешните геноми. Меѓу овие сè уште нерешени прашања, некои од најпроучените се идентитетот на првите жители на Америка, населувањето во Европа и потеклото на земјоделството во Европа.
Фенотипски варијации кај луѓето Анализата на старата ДНК овозможува да бидат проучувани мутациите на фенотипските особини по промените во околината и човековото однесување. Преселувањето кон нови живеалишта, новите промени во исхраната (по преодот кон земјоделството) и изградбата на големи заедници довело до изложување на луѓето на нови услови што на крајот резултирало со биолошко приспособување.
Боја на кожата Преселбата на луѓето надвор од Африка на повисоки географски широчини вклучува помала изложеност на сончева светлина. Бидејќи ултравиолетовите зраци А и Б се клучни за синтезата на витаминот Д, кој го регулира примањето на калциум и затоа е суштински за здравјето на коските, живеењето на повисоки географски широчини би значело значително намалување на синтезата на витаминот Д. Ова извршило нов селективен притисок врз одликата на бојата на кожата, претпочитајќи посветла боја на кожата на повисоки географски широчини. Двата најважни гени вклучени во пигментацијата на кожата се SLC24A5 и SLC45A2. Денес, алелите на „светлата кожа“ на овие гени се фиксирани во Европа, но тие достигнале релативно висока честота дури неодамна (пред околу 5000 години). Ваквата бавна постапка на депигментација наведува дека старита Европејци можеле да се соочат со негативните страни на ниското производство на витамин Д, како што се мускулно-скелетни и кардиоваскуларни состојби. Друга хипотеза е дека Европејците пред земјоделството можеле да ги задоволат своите потреби за витамин Д преку нивната исхрана (бидејќи месото и рибата содржат малку витамин Д)Marciniak S., Perry G. H. Harnessing ancient genomes to study the history of human adaptation. Nature Reviews Genetics volume 18, pages 659–674 (2017)
Прилагодување на земјоделската исхрана Еден од главните примери на приспособување по преминувањето кон земјоделска исхрана е упорноста на производството на ензимот лактаза во зрелоста. Овој ензим е од суштинско значење за варење на лактозата присутна во млекото и диететските производи и неговото отсуство доведува до пролив по консумирањето на овие производи. Упорноста на лактазата е определувана претежно со мутација со една база во генот MCM6 и податоците од старата ДНК покажуваат дека оваа мутација станала вообичаена само во последните 5000 години, илјадници години по почетокот на практиките на млечни производи. Така, дури и во случај на отпорност на лактаза, постои огромно временско доцнење помеѓу почетокот на новата навика и ширењето на прилагодениот алел и затоа потрошувачката на млеко можеби била ограничена на деца или на производи со намалена лактоза.
Друг пример на мутација позитивно избрана со преминот кон земјоделството е бројот на копии на генот AMY1. AMY1 шифрира за ензимот амилаза за варење на скроб присутен во плунката и современите луѓе имаат поголем број на копии на гени во споредба со шимпанзата.
Имунолошки систем