Wilhelm oskarżył ją o cudzołóstwo i od tej pory zaczął planować separację.
Rubens często znajdował się w otoczeniu Anny jako jej doradca, nieformalny skarbnik i prawnik, przez co był podejrzany o utrzymywanie cudzołożnych stosunków ze swoją panią pomiędzy 7 a 10 marca 1571 rokuLinda Rodriguez McRobbie, Niegrzeczne księżniczki. Prawdziwe historie str. 280-281. Został aresztowany poza obrębem murów miejskich Siegen, gdzie zmierzał usiłując się z nią zobaczyć. Poddawano go przesłuchaniu mającemu dostarczyć wiarygodnych zeznań, podczas gdy Anna również znalazła się w krzyżowym ogniu pytań – postawiono jej ultimatum: albo wyzna prawdę, albo Rubens zostanie stracony. 26 marca 1571 roku księżna przyznała się do winy, a 22 sierpnia na świat przyszło jej ostatnie dziecko Krystyna. Na podstawie tych zarzutów, Wilhelm Orański nie uznał jej za swoje dziecko i córka jego żony otrzymała nazwisko van Dietz. 14 grudnia 1571 roku Anna została zmuszona do podpisania ostatecznej zgody na separację z mężem. Dodatkowo Wilhelm Orański nie był skłonny płacić jej alimentów.