Żywe komórki Już w założeniu mikroskopia STED była pomyślana jako przydatna technika do pracy z żywymi komórkami. Jednak do badań konieczne było znakowanie błony komórkowej barwnikami organicznymi. Połączenie STED ze spektroskopią korelacji fluorescencji pokazało, że pewne kompleksy molekularne pułapkują sfingolipidy, ale tylko przejściowo. Jakkolwiek okazuje się, że do obrazowania dowolnego organellum lub białka w żywej komórce można zastosować wyłącznie białka fluorescencyjne.
Problemy Fotowybielanie może następować w wyniku wzbudzenia do jeszcze wyższych poziomów wzbudzonych lub ze wzbudzenia w stanie trypletowym. Aby zapobiec wzbudzeniu z poziomu wzbudzonego w kolejny, wyższy stan wzbudzony, energia fotonu wymagana do wymuszenia emisji nie powinna zachodzić na zakres takiego wzbudzenia. Taka konfiguracja zapewni, że każdy foton padający na fluorofor będzie powodował emisję wymuszoną, zamiast absorpcji ze stanu wzbudzonego. Stany trypletowe są stanami długo żyjącymi w porównaniu ze stanami singletowymi, dlatego aby zapobiec