Cudem ocalony od śmierci książę odpoczywał w pałacu Santa Maria in Portico, ale jego stan był tak zły, że został przewieziony do komnaty w pałacu papieskim gdzie zajmowali się nim jego lekarze z Neapolu, jego siostra Sancha i żona Lukrecja. Kiedy wydawało się, że uda mu się wrócić do pełni zdrowia, w nocy z 18 sierpnia na 19 sierpnia do jego komnaty wtargnął Michelotto Corella wraz z grupą mężczyzn, przekazał obu kobietom rzekomy rozkaz stawienia się w prywatnych komnatach papieża i kiedy tylko wyszły udusił wraz z towarzyszami Alfonsa. Ciało księcia zostało złożone w jednej z kaplic bazyliki św. Piotra.
W politycznym kontekście francuskiej wyprawy na Neapol i zmiany kursu papieskiej polityki głównym podejrzanym stał się Cezar Borgia (noszącego tytuł księcia Valentino) – jego też wkrótce oskarżono. Jednakże zagadka śmierci Alfonsa nie jest tak prosta jak mogłaby się wydawać - na swoją obronę Cezar powiedział, że Alfons próbował go zabić strzałem z kuszy kiedy spacerował po ogrodzie, ale nikt mu nie uwierzył. Poza tym Alfons okazywał sympatię rodowi Colonna co rozwścieczyło ich odwiecznych przeciwników Orsinich i możliwe, że to właśnie oni stali za zamachem na życie księcia z lipca 1500 roku.