W 1500 r. zamek w Brześciu wytrzymał oblężenie 15 tys. Tatarów pod wodzą chana krymskiego Mengli I Gireja, jednak samo miasto zostało spalone. Od 1520 r. Brześć był siedzibą powiatu w nowo utworzonym województwie podlaskim Wielkiego Księstwa Litewskiego. W 1554 r. król Zygmunt II August nadał miastu herb. W 1563 r. w Brześciu Mikołaj Radziwiłł Czarny wydał w języku polskim Biblię brzeską. W 1566 r. król Zygmunt August utworzył województwo brzeskie (brześciańskie) ze stolicą w Brześciu.
W latach wolnej elekcji Na mocy unii lubelskiej w 1569 r. Brześć znalazł się w granicach Rzeczypospolitej Obojga Narodów
Miasto jest znane z zawartej w 1596 r. unii brzeskiej między katolikami a prawosławnymi, która przetrwała na tych terenach 300 lat. mały|Oblężenie Brześcia w 1657 r. Brześć został zdobyty podczas oblężenia Kozaków Chmielnickiego w 1648 r. W latach 1654–1655 wydano konstytucje sejmowe w sprawie fortyfikacji miasta, dzięki czemu Brześć otrzymał dość nowoczesne obwarowania. W tym czasie zamek i miasto były tak silnie ufortyfikowane, że w 1655 r. wojska moskiewskie pod dowództwem Urusowa i Boratyńskiego odstąpiły od oblężenia po odmowie poddania twierdzy przez kasztelana Melchiora Stanisława Sawickiego. Podczas potopu szwedzkiego wojska szwedzkie rozpoczęły oblężenie zamku i miasta w dniu 21 maja 1657.