21 sierpnia 1965 Cooper jako dowódca misji Gemini 5 wystartował w kosmos w dwuosobowej kapsule razem z Charlesem Conradem. Podczas rekordowego w tamtym czasie lotu, który trwał 7 dni 22 godziny 55 minut i 14 sekund, astronauci testowali operacje manewrów na orbicie. Cooper był również pierwszym astronautą, który po raz drugi znalazł się na orbicie. Po pomyślnym wodowaniu 29 sierpnia 1965 został rekordzistą, jeśli chodzi o czas spędzony w kosmosie. Podczas dwóch lotów w sumie spędził poza Ziemią 9 dni 9 godzin 15 minut i 3 sekundy.
W listopadzie 1966 podczas lotu załogowego Gemini 12, ostatniego w programie, był dublerem dowódcy misji.
Cooper uczestniczył również w programie Apollo. W maju 1969 był dublerem dowódcy misji Apollo 10, lotu będącego próbą generalną przed lądowaniem człowieka na Księżycu. Astronauta miał olbrzymią szansę zostać piątym człowiekiem, który postawił stopę na Srebrnym Globie. Na drodze stanął mu jednak Alan Shepard, który po dłuższej przerwie spowodowanej problemami ze zdrowiem, powrócił do zajęć astronauty i został wyznaczony przez NASA na dowódcę misji Apollo 13. Shepard wraz z dowodzoną przez siebie załogą został później przesunięty do misji Apollo 14, ponieważ potrzebował więcej czasu na przygotowanie się do lotu.