Chrzest przyjął w 368 lub 373 roku, po czym został lektorem u boku biskupa Antiochii Melecjusza. Prowadził ascetyczne życie. W 371 r. opuścił Antiochię i udał się na pustynię. Po sześciu latach bycia pustelnikiem powrócił do rodzinnego miasta i przyjął święcenia kapłańskie. Od 381 r. nauczał w kościołach Antiochii. W ciągu dwunastu lat działalności w tym mieście stał się sławnym kaznodzieją dzięki elokwencji swoich publicznych przemówień w Złotym Kościele, katedrze antiocheńskiej, a zwłaszcza dzięki wnikliwym wykładom na temat Biblii i nauczaniu moralnemu, a dzięki swym zdolnościom krasomówczym zyskał przydomek „Złotousty”. Najcenniejszymi jego dziełami z tego okresu są homilie na temat różnych ksiąg biblijnych. Kładł nacisk na jałmużnę i troszczył się o duchowe oraz doczesne potrzeby ubogich. Wypowiadał się przeciwko nadużyciom bogactwa i własności osobistej:
Jego proste rozumienie Pisma Świętego sprawiło, że tematy homilii Jana Złotoustego były praktyczne, wyjaśniając zastosowanie Biblii w życiu codziennym. Takie proste kazania pomogły mu zdobyć szerokie poparcie społeczne.