Początkowa współpraca z braćmi czeskimi stopniowo wygasła w wyniku oporu szlachty, niechętnej tej egalitarnej wspólnocie. W Wielkim Księstwie Litewskim rozwój kalwinizmu zapoczątkował w 1552 Szymon Zacjusz na dworze księcia Mikołaja Radziwiłła Czarnego. W następnym roku odbywały się nabożeństwa reformowane w pałacu książęcym w Wilnie. Książę fundował pierwsze zbory. Inni magnaci litewscy poszli za tym przykładem. Po śmierci Mikołaja Radziwiłła Czarnego (1565), Jednota Litewska rozwijała się dalej pod protektoratem Mikołaja Radziwiłła Rudego (brata królowej Barbary Radziwiłłówny). Ten książę widział w kalwinizmie środek do usamodzielnienia Litwy od Polski i poszerzenia swej władzy. thumb|328x328px|Największy zasięg kalwinizmu w Rzeczypospolitej Obojga Narodów około 1573 Pisarz i działacz Reformacji Jan Łaski stworzył zręby jednolitego ustroju kościelnego – synodalno-prezbiterialnego, który odpowiadał celom szlachty (synod w Książu, 1560). W październiku 1563 roku na synodzie w Pińczowie z Kościoła reformowanego wyłoniła się unitariańska wspólnota braci polskich, których reformowani przezwali „arianami”. Od tego czasu nasiliła się walka z unitarianizmem i jednocześnie współpraca z luteranami. W kwietniu 1570 na synodzie w Sandomierzu, przyjęto II Konfesję helwecką jako płaszczyznę porozumienia z innymi protestantami.