W latach 1629 i 1637 monaster był napadany przez grupy zwolenników unii, dążących do likwidacji ostatniego silnego ośrodka dyzunitów na ziemiach litewskich. Mnisi mieli również problemy z otrzymaniem zezwolenia na budowę nowej, murowanej cerkwi, które ostatecznie uzyskali przywilejem Władysława IV z 1632. W tym samym dokumencie król potwierdzał podległość 17 innych monasterów wobec zwierzchnika monasteru Świętego Ducha. Poświęcenie nowej świątyni miało miejsce 16 kwietnia 1634 i według opowiadań świadków miało zostać zakłócone przez katolików. W 1648, z uwagi na trudności finansowe, przestała działać drukarnia przy monasterze, a w kilka lat później także szkoła.
W drugiej połowie stulecia, w czasie wojen Rzeczypospolitej Obojga Narodów ze Szwecją i Rosją, monaster kilkakrotnie ucierpiał w trakcie działań wojennych lub został splądrowany. Szczególnie podupadł wskutek walk o Wilno w czasie wojny polsko-rosyjskiej 1654–1667;