W mediach Neon Genesis Evangelion Rei pojawia się w Neon Genesis Evangelion jako jedna z głównych bohaterek i pilot jednostki Evangelion-00. Rei po raz pierwszy występuje w pierwszym odcinku anime, poraniona i zabandażowana po nieudanym teście aktywacji z jej Evangelionem. Po tym, jak odzyskuje zdrowie po urazach, pomaga Shinjiemu w pokonaniu Aniołów, a ich pierwsze wspólne poważne zwycięstwo jest przeciwko Ramielowi. Kolejne ważne spotkanie Rei z Aniołem ma miejsce podczas ataku Mataraela na Tokio-3, gdzie dziewczyna współpracuje z Shinjim i Asuką, by go pokonać. Następnie cała trójka walczy z Sahaquielem. Rei pojawia się później w trakcie tworzenia dummy plugów dla Evangelionów. Następnie trójka pilotów walczy z Lelielem. Rei i Asuka próbują pokonać Anioła Zeruela, ale zostają pokonane. Rei zdaje się być zabita, kiedy ratuje Shinjiego podczas walki z Armisaelem pod koniec serialu, ale powraca w tajemniczych okolicznościach; jednak okazuje się, że wskrzeszona Rei jest w rzeczywistości trzecią inkarnacją Rei (pierwsza została zabita jako dziecko przez Naoko Akagi w 2010, a druga zmarła we wcześniej wspomnianym incydencie).