Synteza cytrynianu thumb|left|ΔG'° = −31,4 kJ/mol thumb|Budowa syntazy cytrynianowej W pierwszej reakcji cyklu acetylo-CoA łączy się ze szczawiooctanem. Reakcja kondensacji katalizowana jest przez syntazę cytrynianową. W efekcie tworzy się cytrynylo-CoA, który rozpada się na wolny koenzym A (CoASH) i cytrynian. Ten ostatni jest związkiem sześciowęglowym. U ssaków syntaza cytrynianowa (EC 2.3.3.1) jest dimerem składającym się z dwóch takich samych podjednostek o masie 49 kDa. Miejsca aktywne enzymu znajdują się w szczelinie pomiędzy podjednostkami. Jako pierwsza do enzymu przyłączana jest cząsteczka szczawiooctanu, indukując zmiany konformacyjne umożliwiające przyłączenie acetylo-CoA. W wyniku bliskiego zestawienia obu związków, polaryzacji wiązań oraz odpowiedniej orientacji przestrzennej dochodzi do reakcji kondensacji. Kluczowa dla zajścia reakcji jest obecność w centrum reakcji His-274 oddającej proton na tlen grupy karbonylowej acetylo-CoA oraz Asp-375 usuwającej proton z grupy metylowej. His-320 oddaje proton na atom węgla grupy karbonylowej szczawiooctanu, aktywując go. Oddziaływanie enolu acetylo-CoA z węglem grupy karbonylowej szczawiooctanu prowadzi do powstania wiązania C-C. Powstały cytrynylo-CoA indukuje zmiany konformacyjne i zamknięcie centrum aktywnego.