Kościół w Mikołajkach przed reformacją nie był ujęty w wykazie parafii i kościołów filialnych w archiprezbiteratach warmińskich. Kościół w Mikołajkach najprawdopodobniej obsługiwał krzyżacki kapelan z Rynu. Po sekularyzacji zakonu krzyżackiego, większość mazurskich parafii protestanckich otrzymała pastorów mówiących po polsku. W 1539 Mikołajki zamieszkiwali niemal wyłącznie Polacy. Do Mikołajek w 1552 przybył z Polski pastor Jakub Wilamowski. W 1798 w Mikołajkach prowadzili misje księża z parafii w Świętej Lipce.
Od 1701 Mikołajki stanowiły część Królestwa Prus. Prawa miejskie otrzymały w 1726 od króla pruskiego Fryderyka Wilhelma I, trzy lata później znaczną część zabudowy zniszczył pożar. Na miasteczko złożyły się trzy jednostki osadnicze: Rynek, Koniec i Kozłowo. To ostatnie leży po drugiej stronie jeziora w stosunku do centrum Mikołajek. W 1833 część zabudowy zniszczył pożar. Podczas spisu ludności w 1837 na 1963 mieszkańców jedynie 271 posługiwało się na co dzień językiem niemieckim. W 1843 uruchomiona została stała żegluga na Mazurach powodująca ożywienie miasta. W 1911 Mikołajki uzyskały połączenie kolejowe z Mrągowem i Orzyszem. Od 1920 miasto stało się popularną miejscowością turystyczną, odwiedzili je m.in.