Po odtańczeniu poloneza Mazepa próbuje zalecać się do Amelii, ta jednak wyraźnie daje mu do zrozumienia, że jego zaloty są jej niemiłe i zapowiada, że w razie czego zostanie przed nimi obroniona. Mazepa odprowadza Kasztelanową do jej powozu.
Król szykuje się do snu, a Mazepa pomaga mu się rozebrać. Paź pomstuje po cichu na swego pana, a głośno mówi pochlebstwa na jego temat. Nagle widzi, że król bierze jego płaszcz i kapelusz. Pyta go, dlaczego to robi, na co Jan Kazimierz odpowiada ironicznie, że idzie na podboje miłosne, zaś płaszcz i kapelusz pazia są mu potrzebne po to, by nikt go nie rozpoznał. Wychodzi, ale po chwili wraca z raną na dłoni. Okazało się, że to Zbigniew czuwający nad czcią ukochanej zaatakował jej zalotnika, biorąc go za Mazepę. Król zachowuje się jak urażone dziecko i wyzywa Bogu ducha winnego pazia. Oznajmia mu też, że zamierza jutro opuścić zamek Wojewody. Mazepa z kpiną przypomina władcy, że jeśli jutro wszyscy zobaczą ranę na dłoni króla, to wyjdzie na jaw, kto szedł w zaloty do wojewodziny i wyjazd Jana Kazimierza nic tutaj nie pomoże. Król nie wie, co ma robić. Mazepa jednak sam rani się swoją szablą w dłoń, by ratować swego pana.