W 1509 hospodar mołdawski Bogdan III spalił przedmieścia Lwowa, w tym również kościół bernardyński. Ojcowie bernardyni szybko jednak go odbudowali. W 1581 Sebastian Czepek z Krakowa zbudował nową zakrystię. Pod koniec XVI w. ojciec Bernard Gąsiorek przeprowadził zasadniczą reformę zakonu; zmiany objęły również zakonników we Lwowie, którzy w tym czasie (1600) zaczęli budować nowy kościół i gmachy klasztoru. Fundatorami kościoła byli: wojewoda sandomierski Jerzy Mniszech i starosta lwowski Adam Hieronim Sieniawski. W uroczystości wmurowania kamienia węgielnego wzięli udział również: hetman wielki koronny Jan Zamoyski i hetman polny koronny Stanisław Żółkiewski. Prace budowlane nadzorował prowizor zakonu ojciec Bernard Avellides, który przygotował szkic nowego założenia dla architekta prowadzącego budowę, Pawła Rzymianina. Do starego, drewnianego kościoła została dobudowana wymurowana z kamiennych ciosów trzynawowa bazylika. W trakcie prac postanowiono zbudować też nowe, większe niż pierwotnie zakładano, prezbiterium, które ukończono w 1609, zamykając je apsydą. W 1613 zasklepiono nawę, a w roku następnym ozdobiono ją malowidłami. W 1615 zbudowano kryptę.