Pierwszym oficjalnym rektorem USB został Michał Siedlecki. Językiem wykładowym w okresie międzywojennym był język polski. Jesienią 1919 roku otworzono sześć wydziałów: Humanistyczny, Teologiczny, Prawa i Nauk Społecznych, Matematyczno-Przyrodniczy, Lekarski z oddziałem farmaceutycznym i Sztuk Pięknych. W 1919 otwarta została Biblioteka Uniwersytecka. W 1920 roku na skutek działań wojennych podczas wojny polsko-bolszewickiej USB przerwał działalność. Latem 1920 roku Armia Czerwona zajęła Wilno, a następnie przekazała je Republice Litewskiej. 26 sierpnia 1920 roku wojska litewskie wkroczyły do Wilna. Dopiero 9 października 1920 roku oddziały wojska polskiego pod dowództwem generała Lucjana Żeligowskiego w operacji wojskowej, która weszła do historii pod nazwą buntu Żeligowskiego, zdobyły ponownie Wilno. USB wznowił działalność jesienią 1921 roku. W kolejnych latach USB wzbogacił się o Ogród Botaniczny, Muzeum Etnograficzne, Muzeum Przyrodnicze oraz Obserwatorium Astronomiczne, założone i kierowane przez Wacława Dziewulskiego. Jednym z najlepszych wydziałów była filologia polska, w cieniu której powstała grupa poetycka Żagary, do której m.in. należeli Teodor Bujnicki i Czesław Miłosz. Na wydziale historii kształcił się wówczas Paweł Jasienica, a wykładali m.in.