Zbiory Rdzeniem kolekcji muzealnej jest prywatna kolekcja sztuki królów hiszpańskich, gromadzona od XVI wieku. Pierwszy katalog muzeum został opublikowany w 1819 roku i zawierał wyłącznie malarstwo hiszpańskie (311 obrazów), choć w zbiory muzealne zaliczane było łącznie 1510 obrazów z różnych królewskich rezydencji. Z czasem kolekcja rosła przez liczne darowizny, spadki i transakcje.
Dekretami rządu regencyjnego z 25 listopada 1870 i 22 marca 1872 zlikwidowano Muzeum Trójcy Świętej i przekazano Prado jego zbiory, pochodzące głównie z przejętych przez państwo klasztorów w Madrycie i w innych prowincjach centralnej Hiszpanii. W rzeczywistości po 1873 do Prado włączono tylko 83 prace, prawie wszystkie z inwentarza nowych nabytków, które rozpoczęły się w 1856 roku. Większość zbiorów została rozdystrybuowana do różnych miejsc lub zdeponowana w budynku Villanueva. Wśród najbardziej wartościowych dzieł z Muzeum Trójcy Świętej znalazły się prace El Greca, Berruguete Maíno i malarstwo flamandzkie. Ponad 600 dzieł religijnych, w większości o małej wartości artystycznej, zaginęło lub zostało zniszczonych.