Флуоресценція знайшла широке застосування у різноманітних прикладних біологічних та біомедичних дослідженнях. Це фізичне явище, суть якого полягає в короткочасному поглинанні кванта світла флуорофором (речовиною, що здатна флуоресціювати) із наступною швидкою емісією іншого кванту, що має властивості, відмінні від вихідного. Багато напрямків у біофізиці, молекулярній та клітинній біології виникли та розвиваються саме завдяки впровадженню нових методів, що базуються на флуоресценції. Варто навести декілька прикладів.

Для біофізиків флуоресценція стала швидким та чутливим методом дослідження структури, динаміки та функцій біологічних макромолекул — нуклеїнових кислот та білків.

Метод секвенування ДНК за Сангером був значно вдосконалений у другій половині 1980-х років саме завдяки впровадженню флуоресцентної детекції. Важливим наслідком цього стала вища швидкість та надійність секвенування. Окрім цього метод було автоматизовано.Smith, L. M., Sanders, J. Z., Kaiser, R. J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C. R., Heiner, C., Kent, S. B. H., & Hood, L. E. (1986). Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature, 321(6071), 674—679.Prober, J. M., Trainor, G. L., Dam, R. J., Hobbs, F. W., Robertson, C. W., Zagursky, R. J., Cocuzza, A. J., Jensen, M. A., & Baumeister, K. (1987). A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. Science, 238(4825), 336—341. Це відкрило технічну можливість проведення широкомасштабного (за масштабами того часу) секвенування та дозволило розпочати проєкт «Геном людини» на початку 1990-х років. Крім прямого секвенсування (методом Сангера), флуоресценція продовжує використовуватись у методах секвенування ДНК наступних поколінь ().Shendure, J., & Ji, H. (2008). Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10), 1135—1145.McGinn, S., & Gut, I. G. (2012). DNA sequencing — spanning the generations. New Biotechnology.

Флуоресценція дала новий поштовх для розвитку клітинної біології. Завдяки конфокальній флуоресцентній мікроскопії та розробці нових флуоресцентних міток на базі зеленого флуоресцентного білка (GFP) та його аналогів з'явилась можливість отримувати специфічні контрастні забарвлення та робити фотознімки з високим розділенням багатьох внутрішньоклітинних білкових структур. Розробка нових флуоресцентних зондів — речовин що змінюють флуоресценцію коли до них приєднується певна молекула — дала можливість детально досліджувати хімічний склад живих клітин та навіть організмів, а також його зміни у часі і просторі, що поклало початок флуоресцентній молекулярній візуалізації ().

Починаючи із середини XX-го століття, аналітичні методи, що базуються на використання явища флуоресценції, широко застосовуються у клінічній хімії та молекулярній діагностиці. Зокрема були розроблені та впроваджені чутливі методи для швидкого аналізу стероїдних гормонів, порфіринів, катехоламінів, метаболітів медичних препаратів та інших діагностично важливих хімічних речовин у сечі та плазмі крові. За допомогою імуноферментного аналізу (ELISA) із використанням флуорогенних субстратів проводять детекцію біомаркерів різних захворювань.

Активно розроблюються методи флуоресцентної діагностики in vivo. Зокрема створені флуоресцентні зонди, що селективно забарвлюють злоякісні утворення та допомагають виявляти їх під час ендоскопічного обстеження або томографії. Також на основі флуоресцентного забарвлення тканин були розроблені новітні методики проведення хірургічних операцій для видалення злоякісних пухлин (англ.: image-guided surgery). Перед операцією ракова пухлина селективно забарвлюється флуоресцентним барвником. Під час самої операції спеціальне обладнання реєструє флуоресцентний сигнал, дозволяючи хірургу більш точно розрізняти злоякісну та здорову тканину.

Фізичні основи флуоресценції

Флуоресценція — це одне з явищ, які можуть відбуватись під час взаємодії електромагнітного випромінювання з речовиною.

За нормальних умов переважна більшість молекул перебуває в основному електронному стані. Молекули можуть поглинати кванти електромагнітного випромінювання певної енергії та переходити у збуджений стан. Це відповідає переходу одного електрону з найвищої зайнятої на найнижчу вільну молекулярну орбіталь (ВЗМО → НВМО). Відповідно до їх мультиплетності, основний та збуджений електронні стани позначають та . Збудження більшості флуорофорів () відбувається під дією короткохвильового ультрафіолетового (довжина хвилі 300—400 нм) або видимого (довжина хвилі 400—800 нм) світла. Після переходу флуорофору у збуджений стан відбувається релаксація — процес при якому молекула втрачає частину енергії; при цьому вона опускається до найнижчого коливального підрівня електронного рівня . У рідкому середовищі за нормальних умов цей процес відбувається за час порядку декількох пікосекунд (10−12 с). Згідно з правилом Каші, саме з найнижчого коливального підрівня електронного рівня відбувається перехід в основний електронний стан, що супроводжується флуоресценцією. Через втрати енергії під час релаксації та з деяких інших причин флуоресцентне випромінення має меншу енергію (та відповідно більшу довжину хвилі) у порівнянні зі світлом, що поглинається під час збудження.

На малюнку, що наведений вище, не показані інші процеси, які конкурують із флуоресценцією. Зокрема, за час існування молекули у збудженому стані може відбутись внутрішня конверсія, тобто безвипромінювальний перехід . Існує також можливість переходу молекули у триплетний стан за рахунок інтеркомбінаційної конверсії. Повну картину можливих переходів можна побачити на діаграмі Яблонського. Флуоресценцію не слід плутати з іншими типами люмінесценції, такими як фосфоресценція, Хемолюмінесценція, біолюмінесценція тощо.

Детекція флуоресценції

У найпростішому випадку для спостереження флуоресценції потрібні лише розчин флуоресцентної сполуки та відповідне джерело світла для збудження. Зручним джерелом збудження є ручні ультрафіолетові лампи.

Основними приладами для вивчення флуоресценції в лабораторних умовах є спектрофлуориметри. Сильно спрощена схема такого приладу показана на малюнку.

У спектрофлуориметрах використовують різні джерела збудного світла, найчастіше ксенонові лампи високого тиску. Вони дають широкий спектр емісії (від ультрафіолетового до інфрачервоного світла). Випромінювання від лампи надходить до монохроматору збудження, який дає на виході світло з певною потрібною довжиною хвилі . Після цього монохроматичний промінь направляється на зразок, спричиняючи його флуоресценцію. Важливим є те, що флуоресцентна емісія ізотропна, тобто її інтенсивність однакова по всіх напрямках (не залежить від кута під яким вона спостерігається). Це дає можливість легко відділити її від збудного світла. Розташування детектора під кутом 90° до напрямку збудження дає можливість вловлювати виключно ті фотони, які є результатом флуоресцентної емісії. Флуоресцентне світло пропускається крізь ще один монохроматор (монохроматор емісії, ). Після цього інтенсивність світлового потоку вимірюється за допомогою детектору.

Перераховані тут компоненти (джерело світла, монохроматори, детектор) у різних варіантах і комбінаціях присутні у всіх приладах, що вимірюють флуоресценцію. Залежно від призначення приладу, конфігурація та характеристики кожного з елементів системи можуть змінюватись. Наприклад, замість монохроматорів можуть використовуватись набори світлофільтрів; як джерела монохроматичного світла можуть використовуватись лазери.

Характеристики флуоресцентної емісії Існує ряд кількісних параметрів, що описують флуоресцентне випромінення. Параметр Позначення Опис Інтенсивність флуоресценції , або Цей параметр пропорційний кількості фотонів, які досягають детектора протягом одиниці часу. Вона вимірюється в кількості фотонів за секунду (cps, counts per second), або у відносних одиницях (A.U., arbitrary units). Цей параметр залежить як від досліджуваного зразку, так і від приладу, на якому здійснюють виміри. Спектр флуоресценції Спектр флуоресценції — це залежність інтенсивності флуоресценції від довжини хвилі детекції (λem), записана за сталого значення довжини хвилі збудження (λex). У найпростішому випадку залежність має вигляд асиметричної кривої з одним максимумом. Позиція максимуму емісії показує, яким кольором флуоресціює сполука. Так, максимум флуоресценції при 450 нм приблизно відповідає синьому світлу, максимум при 650 нм означає червону флуоресценцію, тощо. Ширина спектра флуоресценції органічних барвників складає від кількох десятків до кількох сотень нанометрів. Ширина спектра флуоресценції квантових точок є меншою і складає кілька десятків нанометрів. Час життя флуоресценції Для кожної флуоресцентної сполуки можна виміряти величину, що має розмірність часу та має назву «час життя флуоресценції». Це величина порядку наносекунд для більшості флуорофорів. Вона показує усереднений час існування молекули у збудженому стані. Якщо побудувати графік затухання флуоресценції у часі, він буде мати вигляд експоненційної кривої. У найпростішому випадку спадання буде моноекспоненційним, тобто буде мати вигляд прямої у логарифмічних координатах.

Час життя в 1 нс не означає, що флуоресценція зразку повністю зникне за одну наносекунду. Ця величина означає середній час існування збудженого флуорофору у великій популяції. Флуоресценція, подібно до радіоактивного розпаду, є стохастичним процесом. Тобто, кожна окремо взята молекула може випромінити фотон за час як коротший, так і довший . Квантовий вихід флуоресценції Показує, яка частка поглинутих фотонів випромінюється у вигляді флуоресценції. Як зазначалось вище, флуоресценція конкурує з рядом інших процесів, такими як внутрішня та інтеркомбінаційна конверсія. Окрім них існує також можливість руйнування флуорофору шляхом хімічного перетворення (фотознебарвлення). Внаслідок цього кількість фотонів, що випромінюються внаслідок флуоресценції, завжди нижча ніж кількість поглинутих фотонів (Ф < 1).

Суміжні явища, важливі для біологічних застосувань

У дослідженнях біологічних систем корисними є деякі явища, пов'язані з флуоресценцією.

Явище Опис та основні характеристики Анізотропія флуоресценції Показує, наскільки змінюється орієнтація збуджених молекул за час існування збудженого стану. Для вимірювання анізотропії флуоресценції необхідні спектрофлуориметри, що обладнані поляризаторами збудного та флуоресцентного світла. Знаючи інтенсивність флуоресцентного світла, поляризованого у паралельній та перпендикулярній площинах, анізотропію можна розрахувати за формулою:

Анізотропія флуоресценції показує наскільки вільно обертається молекула за час існування збудженого стану. Вільні флуорофори у рідких розчинниках за нормальних умов обертаються швидко, що викликає повну деполяризацію (r = 0). Якщо флуорофор зв'язаний із великою біомолекулою, наприклад із білковою глобулою, такий комплекс обертається в просторі повільніше, що призводить до ненульових значень анізотропії. Теоретично можливий максимум дорівнює 0.4. Анізотропія флуоресценції широко використовується для вивчення білків та взаємодій між ними. Гасіння флуоресценції Інколи інтенсивність флуоресценції суттєво зменшується за наявності певних сполук у розчині. Таке явище називається гасінням флуоресценції, а сполуки що його викликають — гасниками ()

Класичним прикладом є кисень, який є гасником для великої кількості органічних флуорофорів. Математично гасіння флуоресценції описується рівнянням Штерна-Вольмера.

Тут  — відношення початкової флуоресценції до флуоресценції в присутності гасника;  — константа Штерна-Вольмера;  — концентрація гасника. Графік у координатах  — називається графіком Штерна-Вольмера.

Гасіння буває статичним і динамічним. При статичному гасінні флуорофор у основному електронному стані утворює нефлуоресцентний комплекс із гасником. При динамічному гасінні утворюється звичайний збуджений стан, який руйнується гасником ще до того, як встигає відбутись флуоресцентна емісія.