Azotobacter — рід звичайно рухомих, овальних або сферичних вільноживучих грам-негативних бактерій-діазотрофів, що в несприятливих умовах формують оточені товстою стінкою цисти та можуть виробляти значну кількість капсулярного слизу. Представники роду знайдено перш за все у нейтральних та лужних ґрунтах, у водних оточеннях і в асоціації з деякими рослинами. Представники роду мають кілька важливих метаболічних здібностей, зокрема вони фіксують азот, перетворюючи його на аміак. Деякі види Azotobacter мають найвищу швидкість метаболізму серед всіх відомих організмів.
Представники Azotobacter широко вивчаються і як модельний організм, і через можливе застосування у біотехнології. Їх унікальна система трьох ферментів нітрогеназ робить цих бактерій дуже цікавими для вчених, що вивчають фіксацію азоту. Вони потенційно можуть застосовуватися для виробництва альгінової кислоти, штучної фіксації азотуClementi F. 1997. Alginate production by Azotobacter vinelandii.Dixon R and Kahn D. 2004. Genetic regulation of biological nitrogen fixation. Nat Rev Microbiol. 2(8):621-31. (pdf, 463kb) та виробництва деяких біополімерів.
Перший представник роду, Azotobacter chroococcum, був відкритий і описаний в 1901 році голландським мікробіологом і ботаніком Мартінусом Бейєрінком. Зараз до складу роду входять шість видів.
Біологічні властивості Морфологія
Клітини бактерій роду Azotobacter середнього розміру (1—2 мікрон в діаметрі), зазвичай овальні, але володіють плеоморфізмом, тобто можуть мати різну форму — від паличкоподібної до сферичної. На мікроскопічних препаратах клітини можуть розташовуватися поодинці, парами, неправильними скупченнями або, зрідка, ланцюжками різної довжини. Також можуть формувати сплячі форми — цисти, тоді як справжніх спор не утворюють.
В культурі клітини рухомі за допомогою численних джгутиків. За погіршенням умов клітини втрачають рухливість, набувають майже кокоподібної форми і утворюють товстий шар слизу, що формує капсулу клітини. На форму клітини також впливає наявність деяких хімічних компонент середовища — пептон, наприклад, викликає плеоморфізм та індукує утворення так званих «грибоподібних» кліток. Індукуючий вплив на плеоморфізм в культурах представників роду у складі пептону надає амінокислота гліцин.
При мікроскопії в клітинах спостерігаються включення, частина з яких забарвлюється багатьма барвниками (наприклад, залізним гематоксиліном), а частина залишається безбарвною. На початку 20 століття вважалося, що зафарбовані включення є «репродуктивними гранулами» (гонідіями) і беруть участь в розмноженні клітини, виконуючи роль своєрідних «зародкових клітин», хоча пізніше ця гіпотеза була спростована. Зараз відомо, що зафарбовані гранули складаються з волютину (типу нуклеопротеїнів), а безбарвні є краплями жиру. Оскільки ніякої іншої функції гранул показано не було, вважається, що вони є резервним джерелом живлення.
Цисти
Цисти представників роду Azotobacter стійкіші до дії несприятливих факторів зовнішнього середовища, ніж вегетативні клітини — так, цисти в два рази стійкіші до дії ультрафіолетового випромінювання, стійкіші до висушування, гамма-випромінювання, сонячної радіації, дії ультразвуку, проте не є стійкими до дії високих температур.
Формування цист (інцистування) індукується зміною концентрації поживних речовин в живильному середовищі і додаванням деяких органічних речовин (наприклад етанолу, н-бутанолу і β-гідроксибутірату). Цисти рідко утворюються в рідких живильних середовищах. Утворення цист супроводжується метаболічними змінами, зокрема змінами в катаболізмі, диханні і біосинтезі макромолекул. В процесі утворення цисти беруть участь багато білків клітини, зокрема певне значення мають альдегіддегідрогеназа та регулятор відповіді AlgR.
Циста Azotobacter — сферичне тіло, що складається з так званого центрального тіла: зменшеної копії вегетативної клітини з великою кількістю вакуолей, і двошарової оболонки, внутрішня частина якої називається інтима і має волокнисту будову, а зовнішня називається екзина і представлена рівною структурою, що оточує цисту та має гексагональну кристалічну будову. Екзина частково гідролізуєтся трипсином і стійка до дії лізоциму, на відміну від центрального тіла. Центральне тіло може бути ізольоване в життєздатному стані деякими хелатуючими агентами. Головними компонентами зовнішньої оболонки цисти є алкілрезорціноли, що складаються з довгих аліфатичних ланцюжків і ароматичних кілець, ці речовини зустрічаються також у інших бактерій, тварин і рослин.
Проростання цист
Цисти Azotobacter є сплячими формами клітини, необхідними для переживання несприятливих умов зовнішнього середовища, але не призначеними для розмноження. Після відновлення сприятливих умов, таких, як значення кислотності, температури і наявності доступного джерела вуглецю, цисти проростають, в результаті чого утворюються вегетативні клітини, що знов розмножується шляхом бінарного поділу. При проростанні цист екзина цисти ушкоджується, і вивільняється велика вегетативна клітина.
При спостереженні першою проявою проростання спор є поступове зниження переломлення світла цистами, помітне при фазово-контрастній мікроскопії або вимірюванні розсіяння світла. Проростання цист — повільний процес, що триває близько 4—6 годин, впродовж яких центральне тіло збільшується і відбувається захоплення гранул волютину, що раніше знаходилися в інтимі. Потім екзина лопається і вегетативна клітина характерної підковоподібної форми вивільняється з екзини. При проростанні цисти знову відбуваються метаболічні зміни. Відразу після збільшення концентрації джерела вуглецю цисти починають поглинати кисень і виділяти діоксид вуглецю, зокрема швидкість дихання підвищується до максимальних значень через 4 години після збільшення концентрації глюкози. Біосинтез білків і РНК також починається після збільшення концентрації джерела вуглецю у середовищі, проте активізація синтезу макромолекул відбувається повільніше після збільшення концентрації джерела вуглецю. Так, синтез ДНК і фіксація азоту ініціюються через 5 годин після збільшення концентрації глюкози у безазотному живильному середовищі.
Під час проростання цист відбуваються зміни і в інтимі, видимі на електронно-мікроскопічних знімках. Інтима складається з вуглеводів, ліпідів і білків та займає майже такий же об'єм клітини, що і центральне тіло. Під час проростання цист інтима гідролізується та використовується клітиною для синтезу її компонентів.
Фізіологічні властивості
Бактерії Azotobacter отримують енергію в ході окислювально-відновних реакцій, використовуючи як донора електрону органічні сполуки. Для росту їм необхідний кисень, але вони здатні рости при знижених концентраціях кисню, утворюють каталазу і оксидазу. Здатні використовувати різні вуглеводи, спирти і солі карбонових кислот як джерела вуглеця. Ці бактерії — діазотрофи (азотфіксатори), здатні фіксувати принаймні 10 мг азоту на грам спожитої глюкози, фіксація азоту залежить від наявності іонів молібдену, відсутність молібдену може бути частково заміщена іонами ванадію. Як джерело азоту можуть використовувати нітрати, іони амонію і амінокислоти. Оптимальна кислотність для росту і фіксації азоту — pH 7,0—7,5, але клітини здатні рости в діапазоні pH від 4,8 до 8,5. Можливий також залежний від водню міксотрофний ріст представників роду на безазотному живільному середовищі, що містить манозу. Оскільки водень доступний в ґрунті, ймовірно міксотрофія цих бактерій відбувається і в природних умовах.
Культуральні властивості Представники роду Azotobacter здатні використовувати вуглеводи (наприклад манітол, цукрозу, глюкозу), спирти (зокрема етанол і бутанол) і солі органічних кислот, зокрема і бензоати, як джерело вуглецю і енергії. Представники роду ростуть на безазотистих середовищах, призначених для виділення вільноживучих азотфіксуючих і олігонітрофільних організмів, наприклад на середовищі Ешбі, що містить джерело вуглецю (манітол, сахароза або глюкоза) і необхідні мікроелементи (джерело фосфора, сірки і т. д.), або на середовищі Федорова, що містить більше мікроелементів, а також у рідкому середовищі Бейєрінка.
На твердих живильних середовищах представники роду утворюють плоскі, слизисті колонії пастоподібної консистенції діаметром 5—10 мм, в рідких живильних середовищах утворюють біоплівки. Характерна також пігментація, колонії представників роду можуть бути забарвлені в темно-коричневий, зелений та інші кольори, або можуть бути безбарвними, залежно від штаму. Бактерії Azotobacter є мезофільними мікроорганізмами і ростуть при температурі 20—30 °C.
Пігменти
Багато представників роду Azotobacter синтезують різноманітні пігменти. Наприклад, типовий вид роду Azotobacter chroococcum виробляє темнокоричневий водорозчинний пігмент (у видовому епітеті якраз відображена ця здатність) меланін. Продукція меланіну у A. chroococcum спостерігається при високих рівнях дихання під час фіксації азоту і, ймовірно, також захищає нітрогеназну систему від дії кисню при аероадаптації. Інші види роду також продукують пігменти від жовто-зеленого до пурпурного кольору. Також представники роду здатні виробляти флюоресцентний пігмент, що випромінює жовто-зеленим кольором, і пігмент, що випромінює біло-блакитним кольором.
Геном
Частково завершено визначення нуклеотидної послідовності хромосоми Azotobacter vinelandii штаму AvOP. Хромосома A. vinelandii — кільцева молекула ДНК розміром 5342073 пар основ, що містить 5043 генів, з яких 4988 кодують білки, вміст ГЦ становить 65 %Azotobacter vinelandii AvOP, unfinished sequence, whole genome shotgun sequencing project, NCBI. Відмічена також зміна плоїдності бактерій Azotobacter в міру «старіння» культур: кількість хромосом в клітинах та вміст ДНК збільшується в стаціонарній фазі, де бактерії можуть містити понад 100 копій хромосоми на клітину. При пересіванні на свіже живильне середовище первинний вміст ДНК (одна копія) відновлюється. Крім хромосомної ДНК, у представників роду також знайдені плазміди та показана можливість трансформації бактерій екзогенною плазмідою.
Систематика
Рід Azotobacter був вперше описаний в 1901 році голландським мікробіологом і ботаніком, одним із засновників екологічної мікробіології Мартінусом Бейєрінком на основі вперше виділеного та описаного їм виду Azotobacter chroococcum, першого відомого аеробного вільноживучого діазотрофа.
В 1903 році Ліпман (Lipman) описав вид Azotobacter vinelandii Lipman, 1903, а роком пізніше Azotobacter beijerinckii Lipman, 1904, названий їм на ім'я самого Мартінуса Бейєрінка. В 1949 році радянський мікробіолог Микола Олександрович Красильников описав вид Azotobacter nigricans Krasil'nikov, 1949, в 1981 році розділений Томпсоном (Thompson) и Скерманом (Skerman) на два підвиди:Azotobacter nigricans subsp. nigricans Krasil'nikov, 1949 і Azotobacter nigricans subsp. achromogenes Thompson and Skerman, 1981, в тому же році Томпсон і Скерман описали вид Azotobacter armeniacus Thompson and Skerman, 1981. В 1991 році Пейдж (Page) і Шивпрасад (Shivprasad) описали мікроаерофільний, залежний від іонів натрію аеротолерантний вид Azotobacter salinestris Page and Shivprasad 1991.
Спочатку рід відносили до родини Azotobacteraceae Pribram, 1933, проте пізніше він був перенесений до родини Pseudomonadaceae, засновуючись на молекулярно-систематичних дослідженнях нуклеотидних послідовностей 16S рРНК. У 2004 році було проведене філогенетичне дослідження, яке виявило, що Azotobacter vinelandii входить до одної клади з бактерією Pseudomonas aeruginosa, а в 2007 році було зроблене припущення про близькість родів Azotobacter, Azomonas і Pseudomonas та про можливу синонімічність.
До роду Azotobacter раніше також відносили види Azotobacter agilis (в 1938 році перенесений Виноградським до роду Azomonas), Azotobacter macrocytogenes (перенесений в 1981 році до роду Azomonotrichon, а в 1982 році, із скасуванням Azomonotrichon, до роду Azomonas) і Azotobacter paspali (перенесений в 1981 році до роду Azorhizophilus).
Розповсюдження