Генотипування SNP – це вимірювання генетичних варіацій однонуклеотидних поліморфізмів (SNP) між представниками виду. Це форма генотипування, тобто дослідження відмінностей у генетичному складі (генотипі) особини шляхом дослідження послідовності ДНК особини за допомогою біологічних аналізів та порівняння її з послідовністю іншої особини або референтною послідовністю геному. SNP є найпоширенішим типом генетичної варіації, тобто зустрічається найчастіше в генотипі якщо порівнювати з референтною послідовністю геному. SNP – це мутація однієї пари основ у певному локусі генотипу конкретної особи. SNP впливають на багато захворювань людини та стають особливо цікавими у фармакогенетиці. тако, враховуючи той факт, що SNP зберігаються під час еволюції та передаються від батьків дітям, їх було запропоновано як маркери для використання в аналізі кількісних локусів ознак (QTL) та в дослідженнях генетичної асоціації замість мікросателітів . SNP також використовуються для ідентифікації конкретної людини, так званого генетичного відбитку особи,для цілей оперативно-розшукових дій та доказової бази в судах.
Методи на основі гібридизації Було розроблено кілька методик, які дозволяють досліджувати SNP шляхом гібридизації комплементарних ДНК з місцем розміщення SNP.
Динамічна гібридизація Динамічне генотипування за допомогою алель-специфічної гібридизації (DASH) використовує різницю в температурі плавлення ДНК, що виникає внаслідок нестабільності неспівпадаючих пар основ. Процес може бути значно автоматизований і охоплює кілька простих принципів.
На першому етапі геномний сегмент ампліфікується та приєднується до кульки за допомогою ПЛР-реакції з біотинільованим праймером. На другому етапі ампліфікований продукт приєднується до колонки зі стрептавідином та промивається NaOH для видалення небіотинільованого ланцюга. Потім додається алель-специфічний олігонуклеотид у присутності молекули, яка флуоресціює при зв'язуванні з дволанцюжковою ДНК. Інтенсивність вимірюється при підвищенні температури, доки не можна буде визначити температуру плавлення . Наявність SNP призведе до нижчої, ніж очікувалося, температури плавлення.
Оскільки генотипування DASH кількісно вимірює зміну температури плавлення, воно здатне вимірювати всі типи мутацій, а не лише SNP.
Молекулярні маяки Процес виявлення SNP за допомогою молекулярних маяків використовує спеціально сконструйований одноланцюговий олігонуклеотидний зонд. Олігонуклеотид розроблений таким чином, що на кожному кінці є комплементарні області, а послідовність зонда розташована між ними. Така конструкція дозволяє зонду набувати структури шпильки або петлі-стебла в його природному, ізольованому стані. До одного кінця зонда прикріплений флуорофор, а до іншого - гаситель флуоресценції. Через структуру зонда "стебло-петля" флуорофор знаходиться близько до гасителя, що запобігає випромінюванню флуоресценції молекулою. Молекула також сконструйована таким чином, що лише послідовність зонда комплементарна геномній ДНК, яка буде використана в аналізі.
Якщо послідовність зонда молекулярного маяка зустріне свою цільову геномну ДНК під час аналізу, вона активується та гібридизується. Через довжину послідовності зонда, шпильковий сегмент зонда буде денатурований на користь утворення довшого, стабільнішого гібрида зонд-мішень. Ця конформаційна зміна дозволяє молекулі флуоресцувати.
З іншого боку, якщо послідовність зонда зустрічає цільову послідовність навіть з одним некомплементарним нуклеотидом, молекулярний маяк переважно залишатиметься у своєму природному шпильковому стані, і флуоресценція не спостерігатиметься.
Унікальна конструкція цих молекулярних маяків дозволяє проводити простий діагностичний аналіз для ідентифікації SNP у шуканому місці. Якщо один молекулярний маяк розроблений для збігу з алелем дикого типу, а інший – для мутанта алеля, ці два можна використовувати для ідентифікації генотипу особини.
SNP-мікрочипи
У SNP-чипах сотні тисяч спеціальних зондів розміщені на невеликому чіпі, що дозволяє одночасно досліджувати багато SNP. Оскільки алелі SNP відрізняються лише одним нуклеотидом, і оскільки важко досягти оптимальних умов гібридизації для всіх зондів на масиві зонду, цільова ДНК має потенціал для гібридизації з неспареними зондами. Це частково вирішується використанням кількох надлишкових зондів для дослідження кожного SNP. Зонди розроблені таким чином, щоб розміщення SNP знаходилося в кількох різних місцях, а також містили неспареності з алелем SNP. Порівнюючи різну кількість гібридизації цільової ДНК з кожним із цих надлишкових зондів, можна визначити специфічні гомозиготні та гетерозиготні алелі. Хоча олігонуклеотидні мікрочипи мають порівняно нижчу специфічність і чутливість, масштаб SNP, які можна дослідити, є основною перевагою. GeneChip Affymetrix Human SNP 5.0 виконує геномний аналіз, який може генотипувати понад 500 000 людських SNP. [ потрібне повне посилання ]
Методи на основі ферментів Для створення високоточних методів генотипування SNP було використано широкий спектр ферментів, включаючи ДНК-лігазу, ДНК-полімеразу та нуклеази .
Поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів Поліморфізм довжини рестрикційних фрагментів (ПДРФ) вважається найпростішим і найпершим методом виявлення однонуклеозних поліморфізмів (SNP). ПДРФ використовує багато різних рестрикційних ендонуклеаз та їхню високу спорідненість до унікальних і специфічних сайтів рестрикції. Виконуючи розщеплення геномного зразка та визначаючи довжину фрагментів за допомогою гель-аналізу, можна встановити, чи розрізали ферменти очікувані сайти рестрикції. Невдача у розрізанні геномного зразка призводить до отримання фрагмента, який є значно більшим за очікуваний, що означає наявність мутації в точці сайту рестрикції, яка захищає його від активності нуклеаз.
Поєднання таких факторів, як висока складність більшості еукаріотичних геномів, вимога до специфічних ендонуклеаз, той факт, що точну мутацію не обов'язково можна визначити в одному експерименті, та повільна природа гель-аналізів, робить ПДРФ поганим вибором для високопродуктивного аналізу.
Методи на основі ПЛР ПЛР з рефрактерною мутаційною системою на основі тетрапраймерної ампліфікації, або ARMS-ПЛР, використовує дві пари праймерів для ампліфікації двох алелів в одній ПЛР-реакції. Праймери розроблені таким чином, що дві пари праймерів перекриваються в місці розташування SNP, але кожна ідеально відповідає лише одному з можливих SNP. Основою винаходу є те, що несподівано олігонуклеотиди з невідповідним 3'-залишком не функціонуватимуть як праймери в ПЛР за відповідних умов. Як результат, якщо в ПЛР-реакції присутній даний алель, пара праймерів, специфічна для цього алеля, дасть продукт, але не для альтернативного алеля з іншим SNP. Дві пари праймерів також розроблені таким чином, що їхні ПЛР-продукти мають значно різну довжину, що дозволяє легко розрізняти смуги за допомогою гель-електрофорезу або аналізу температури розплаву. При дослідженні результатів, якщо геномний зразок є гомозиготним, то ПЛР-продукти, що утворюються, будуть отримані з праймера, який відповідає місцю розташування SNP, та зовнішнього протилежного ланцюгового праймера, а також з двох зовнішніх праймерів. Якщо геномний зразок гетерозиготний, то продукти будуть отримані з праймера кожного алеля та їхніх відповідних зовнішніх праймерів-аналогів, а також зовнішніх праймерів.
Альтернативна стратегія полягає у проведенні кількох реакцій кПЛР з різними наборами праймерів, які окремо націлені на кожен алель. Добре розроблені праймери ампліфікуватимуть свій цільовий SNP на набагато ранішому циклі, ніж інші SNP. Це дозволяє розрізнити більше двох алелів, хоча для кожного SNP потрібна окрема реакція кПЛР. Для досягнення достатньо високої специфічності послідовність праймерів може вимагати розміщення штучного невідповідності поблизу її 3'-кінця, що є підходом, загальновідомим як Taq-MAMA.
Клапкова ендонуклеаза Клапкова ендонуклеаза (FEN) – це ендонуклеаза, яка каталізує структурно-специфічне розщеплення. Це розщеплення є дуже чутливим до невідповідностей і може бути використане для дослідження SNP з високим ступенем специфічності Аналіз плавлення з високою роздільною здатністю – це найпростіший для розуміння метод на основі ПЛР. По суті, тут застосовуються ті ж термодинамічні властивості, що й гелевими методами, причому в режимі реального часу. Флуориметр контролює денатурацію всього амплікону дволанцюгової ДНК після ПЛР. Ви створюєте праймери, специфічні для ділянки, яку потрібно ампліфікувати. Ви «фарбуєте» амплікон дволанцюговим специфічним барвником, що входить до складу ПЛР-суміші. Специфічний для дволанцюгової ДНК барвник інтегрується в продукт ПЛР. По суті, весь амплікон стає зондом. Це відкриває нові можливості для відкриттів. Ви або розміщуєте праймери дуже близько до будь-якої сторони досліджуваного SNP (генотипування малих ампліконів) , або ампліфікуєте більшу область (довжиною 100–400 пар основ) для цілей сканування. Для простого генотипування SNP простіше просто зробити амплікон малим, щоб мінімізувати ймовірність сплутати один SNP з іншим. Визначається температура плавлення (Tm) усього амплікону, і більшість гомозигот достатньо відрізняються (у кращих приладах) за Tm від генотипу. Гетерозиготи ще легше диференціювати, оскільки вони мають утворені гетеродуплекси (див. пояснення на основі гелю), що розширює перехід плавлення та зазвичай дає два помітні піки. Описано плавлення амплікону з використанням флуоресцентно міченого праймера , але це менш практично, ніж використання ds-специфічних барвників через вартість флуорогенного праймера.
Сканування більших ампліконів базується на тих самих принципах, що й описані вище. Однак температура плавлення та загальна форма кривої плавлення стають інформативними. Для ампліконів >c.150bp часто присутні >2 піки плавлення, кожен з яких може змінюватися залежно від складу ДНК-матриці. Численні дослідники змогли успішно виключити більшу частину їх секвенування за допомогою сканування на основі плавлення, що дозволило провести точне генотипування великої кількості особин на основі локусів. Багато дослідників виявили сканування на наявність мутацій за допомогою плавлення з високою роздільною здатністю як життєздатний та практичний спосіб вивчення цілих генів.
Використання білків, що зв'язують неспарені ДНК Білки, що зв'язують неспарені ДНК, можуть розрізняти неспарені одиниці нуклеотидів і таким чином полегшувати диференціальний аналіз SNP. Наприклад, білок MutS з Thermus aquaticus зв'язує різні неспарені одиниці нуклеотидів з різною афінністю і може бути використаний у капілярному електрофорезі для диференціації всіх шести наборів неспарених ДНК.
SNPlex SNPlex — це власна платформа генотипування, яку продається Applied Biosystems .
Аналіз нуклеази Surveyor Нуклеаза Surveyor — це фермент ендонуклеази з порушенням парності нуклеази, який розпізнає всі заміни основ та невеликі вставки/делеції (інделеції) і розщеплює 3′-бік неспарених сайтів в обох ланцюгах ДНК.
Секвенування Технології секвенування наступного покоління, такі як піросеквенування послідовностей менше 250 основ у зчитуванні, обмежують їхню здатність секвенувати цілі геноми. Однак їхня здатність генерувати результати в режимі реального часу та потенціал для масового масштабування роблять їх життєздатним варіантом для секвенування невеликих ділянок для проведення генотипування SNP. Порівняно з іншими методами генотипування SNP, секвенування особливо підходить для ідентифікації кількох SNP у невеликій ділянці, такій як високополіморфна ділянка головного комплексу гістосумісності геному.
Посилання
Міжнародний проект HapMap. Проєкт персоналізованої медицини долини Делавер використовує поліморфізми (SNP), щоб зробити медицину персоналізованою Генотипування за допомогою аналізу лігування олігонуклеотидів (OLA) Чому SNP тестує мишей?