3′-Нетранслируемая область

3′-Нетранслируемая область (3′-НТО, ) — некодирующий участок мРНК, располагающийся на её 3′-конце после . Такое же название имеет участок ДНК, соответствующий 3′-UTR транскрипта. 3′-UTR может принимать участие в регуляции эффективности трансляции, стабильности мРНК, содержать сигналы полиаденилирования и сайты связывания микроРНК, а также выполнять ряд других регуляторных функций.

Структура

Длина и нуклеотидный состав Длина 3′-UTR может составлять от 60 до 4000 нуклеотидов. Средняя длина 3′-UTR у человека составляет около 800 нуклеотидов, в то время как средняя длина 5′-UTR — 200 нуклеотидов. Примечательно, что общая длина 3′-UTR у человека более чем в два раза превосходит таковую у остальных млекопитающих, что свидетельствует о большем, чем у других млекопитающих, числе регуляторных элементов у людей. Состав оснований также различается в 3′- и 5′-UTR. Так, в 5′-UTR выше содержание G+C, чем в 3′-UTR. Особенно это различие заметно в мРНК теплокровных позвоночных, у которых содержание G+C в 5′-UTR составляет 60 %, а в 3′-UTR — 45 %Здесь и далее в разделах «Структура» и «Функции» приводится информация по эукариотическим клеточным 5′-UTR. Данные по 5′-UTR бактерий, архей и вирусов рассматриваются в соответствующем разделе..

Длина и вторичная структура 3′-UTR в значительной мере определяются её участием во взаимодействиях 5’-конца транскрипта с 3’-концом (см. ниже), и нередко длинные 3′-UTR оказывают значительное влияние на экспрессию генов. В 1996 году было показано, что увеличение 3′-UTR мРНК с 19 до 156 нуклеотидов уменьшало экспрессию в 45 раз, вне зависимости от ориентации, гена или последовательности вставленных нуклеотидов. Это свидетельствует о том, что длина 3′-UTR имеет важное значение в экспрессии мРНК. Другим фактором, определяющим важность длины 3′-UTR, кроме взаимодействия 3′- и 5′-UTR, является способность 3’-UTR к взаимодействию с микроРНК — особыми регуляторными молекулами РНК, подавляющими трансляцию (подробнее см. ниже). Эти взаимодействия осуществляются на специальных сайтах, которых больше в длинных 3′-UTR, поэтому длинная 3′-UTR может оказывать более сильный подавляющий эффект на трансляцию. Так, было проведено сравнение длины 3′-UTR и количества сайтов связывания с микроРНК на ней у генов рибосомных белков и генов, участвующих в нейрогенезе. Оказалось, что у генов рибосомных 3′-UTR короче и меньше специфических сайтов связывания с микроРНК, а у генов, вовлеченных в нейрогенез, наоборот, 3′-UTR длиннее и содержит много специфических сайтов связывания с микроРНК. Рассмотрим другой пример. Ген использует альтернативные 3′-UTR для гибкого контроля экспрессии (подробнее об этом явлении см. ниже). Более длинная из возможных 3′-UTR этого гена содержит консервативные сайты связывания двух микроРНК, экспрессирующихся в активированных Т-клетках. При активации относительная экспрессия транскрипта с более длинной 3′-UTR снижалась, а общая экспрессия белка увеличивалась, так как экспрессировались мРНК с более короткими 3′-UTR, не содержащие сайтов связывания для подавляющих микроРНК. Показано также, что длина 3′-UTR зависит от наличия в ней таких регуляторных элементов, как AU-богатые элементы (ARE) (подробнее см. ниже).

В общем, длинные 3′-UTR приурочены к относительно невысокому уровню экспрессии, как было показано в экспериментах, в которых проводилось сравнение экспрессии изоформ одного белка, чьи мРНК различались лишь по длине 3′-UTR. Ген экспрессируется в две мРНК с различающимися 3′-UTR, причём более длинная из них содержит дополнительный сайт связывания микроРНК. Функциональный полиморфизм в этом гене связан с появлением дисфункции эндотелия и наследственной предрасположенностью к гипертонии. Интересно, что аллель, отвечающий за проявление этих расстройств, обычно имеет более длинную 3′-UTR, в связи с чем его уровень экспрессии ниже, чем у аллеля дикого типа, имеющего более короткую 3′-UTR.

Интроны В отличие от 5′-UTR, 3′-UTR содержат относительно мало интронов (около 5 %). У некоторых генов млекопитающих, появившихся в результате обратной транскрипции со сплайсированного транскрипта, имеются интроны в 3′-UTR, которые снижают экспрессию этих генов, направляя их транскрипты на путь NMD (то есть на разрушение). Этот отрицательный эффект интронов в 3′-UTR на экспрессию генов, возможно, объясняет их малое распространение в этой области. Более того, установлено, что некоторые транскрипты способны связываться с микроРНК только при наличии интрона в 3′-UTR, что также подавляет экспрессию гена. Это показывает, что различное вырезание интронов в 3′-UTR даёт возможность для изоформо-специфичной регуляции, опосредованной микроРНК, которая может осуществляться тканеспецифично.

Вторичная структура По-видимому, вторичная структура 3’-UTR имеет гораздо большее значение, чем считалось ранее. Важна не только длина 3’-UTR, но и её вторичная структура, и мутации, изменяющие её, могут нарушить экспрессию гена. В 2006 году было проведено исследование 83 вариантов 3′-UTR, приуроченных к различным заболеваниям, и была установлена связь между функциональностью этих вариантов и изменениями в предсказанной вторичной структуре.

Вторичную структуру 3′-UTR сложно предсказать, так как множество связывающихся с ней белковых факторов могут значительно влиять на её пространственную структуру. Эти факторы могут изменять её из-за разрушения укладки мРНК, а могут взаимодействовать с другими факторами, из-за чего мРНК может замкнуться в петлю. Наиболее распространённым примером элементов вторичной структуры, способных влиять на экспрессию, является шпилька, и в 3’-UTR именно со шпильками связываются РНК-связывающие белки. Транскрипт нейротрофического фактора мозга () содержит длинную шпильку, ответственную за стабильность мРНК в нейронах в ответ на кальциевые сигналы. Предполагается, что шпилька представляет собой удобную площадку для взаимодействия ряда РНК-связывающих белков, некодирующих РНК и сигналов полиаденилирования в ответ на Са2+. У транскрипта TNFα в 3′-UTR располагается элемент ARE, образующий шпильку, которая способна модулировать сродство этого участка к различными белкам (подробнее см. ниже). Эти примеры показывают, что модуляция вторичной структуры 3’-UTR при помощи белков или иных средств может изменять её специфичность к связыванию с различными транс'′-факторами, тем самым регулируя экспрессию генов на пост-транскрипционном уровне.

Альтернативные 3′-UTR Альтернативное полиаденилирование () и альтернативный сплайсинг являются двумя механизмами, приводящими к появлению различных изоформ мРНК, различающихся своими 3′-UTR. APA может происходить из-за наличия разных сайтов полиаденилирования и различных терминальных экзонов; APA используют предположительно ~50 % человеческих генов. Этот механизм очень удобен для сложных организмов, так как он даёт возможность транскриптам экспрессироваться в один и тот же белок, но на различном уровне и в различной пространственной локализации из-за различий в регуляции, опосредованной 3′-UTR. Альтернативные 3′-UTR чрезвычайно важны для тканеспецифичной экспрессии генов, а также для различной экспрессии на разных этапах развития. Значительные изменения продуктов АРА характерны для ряда видов рака. АРА также играет важную роль в локализации изоформ белка. Белковый продукт гена является ARE-связывающим белком, участвующим в стабилизации многих мРНК, содержащих ARE. Благодаря АРА образуется ряд вариантов белка HuR, различающихся по уровню экспрессии, и, хотя у подавляющего большинства транскриптов этого белка отсутствует ARE, у некоторых всё-таки есть функциональные ARE в 3′-UTR. Эти ARE способны связывать HuR, тем самым осуществляя регуляцию по типу положительной обратной связи. Таким образом, использование альтернативных 3′-UTR даёт возможность для ещё большего разнообразия белковых продуктов одного гена.

Функции

Взаимодействие с микроРНК

МикроРНК — короткие одноцепочечные некодирующие молекулы РНК эндогенного происхождения длиной около 20 нуклеотидов. Они взаимодействуют с мРНК-мишенями по принципу комплементарности и обычно блокируют трансляцию мишени или вызывают её разрушение. Как правило, сайты связывания микроРНК с мРНК локализованы в 3′-UTR последней, хотя некоторые из них находятся в 5′-UTR и даже кодирующей области. МикроРНК часто экспрессируются по-разному в зависимости от типа ткани и стадии развития, и генам, вовлечённым в общие для всех генов процессы, приходится селективно избегать последовательностей в транскриптах, частично комплементарных микроРНК, то есть избегать наличия сайтов связывания с микроРНК. Этот процесс селективного избегания оказывает огромное влияние на эволюцию 3′-UTR.

Стабилизация мРНК

Изменение стабильности транскрипта позволяет осуществлять быстрый контроль экспрессии без изменения темпов трансляции. Такой механизм имеет важное значение в таких жизненно важных процессах, как клеточный рост и дифференциация, а также адаптация к условиям окружающей среды. Наиболее хорошо изученными регуляторными элементами, регулирующими стабильность мРНК, являются AU-богатые элементы (), располагающиеся в 3′-UTR мРНК некоторых генов. Эти элементы имеют размер от 50 до 150 нуклеотидов и обычно содержат многочисленные копии пентануклеотида AUUUA.

Было установлено, что последовательности AREs различаются, и по количеству и расположению мотивов AUUUA выделяют 3 класса AREs: I класс: 1—3 разбросанно расположенных AUUUA внутри U-богатого участка; II класс: множество перекрывающихся мотивов AUUUA; III класс: AUUUA нет, но есть U-богатые участки.

AREs связываются с белками (), которые, как правило, способствуют разрушению мРНК в ответ на различные внутри- и внеклеточные сигналы, хотя некоторые из них регулируют трансляцию. AREs регулируют экспрессию генов, кодирующих цитокины, факторы роста, генов-супрессоров опухолей, протоонкогенов, а также генов, чьи белковые продукты участвуют в регуляции клеточного цикла, например, гены циклинов, ферментов, факторов транскрипции, рецепторов и мембранных белков. Такое разнообразие генов, чьи транскрипты содержат AREs, свидетельствует о важности стабильности транскрипта в регуляции гена. Кроме изменения стабильности мРНК, ARE могут также активировать трансляцию, хотя этот механизм менее распространен и хуже понятен.

Другим элементом, регулирующим стабильность транскрипта, является недавно открытый GU-богатый элемент (GRE). Он взаимодействует с  — РНК-связывающим белком, способствующим распаду связанной с ним мРНК.

Участие в полиаденилировании

Полиаденилирование представляет собой процесс добавления серии аденозинов (то есть поли(А)-хвоста) к 3′-концу ещё незрелого РНК-транскрипта. Установлено, что в 3′-UTR располагаются элементы, регулирующие этот процесс. Так, показано, что во всех полиаденилируемых мРНК на расстоянии 20—30 нуклеотидов от 3′-конца транскрипта, к которому присоединяется поли(А)-хвост, содержится последовательность AAUAAA — сигнал полиаденилирования (сигналами полиаденилирования могут также выступать близкие последовательности, такие как AU/GUAAA или UAUAAA). Впоследствии оказалось, что, хотя последовательность AAUAAA абсолютно необходима для полиаденилирования, существуют и другие элементы, без которых нормальное присоединение поли(А)-хвоста невозможно. В частности, была выявлена GU-богатая последовательность, располагающаяся сразу после AAUAAA в направлении к 3' концу (её также называют ), а также особая последовательность, располагающаяся сразу перед AAUAAA (). Эти элементы в значительной мере консервативны не только для млекопитающих, но и для всех эукариот. Для полиаденилирования важны также нуклеотиды, располагающиеся в месте разрезания 3′-конца транскрипта (к этому месту после разрыва будет присоединён поли(А)-хвост). Таким образом, 3′-UTR играет важнейшую роль в процессе полиаденилирования.

Участие в маскировании мРНК