Метод локальной фиксации потенциала, patch-clamp ( — фрагмент, clamp здесь — фиксация) — электрофизиологическая методика для изучения свойств ионных каналов, состоящая в том, что фрагмент клеточной мембраны изолируется с помощью специальной микропипетки. Эта методика даёт возможность экспериментатору контролировать разность потенциалов между сторонами мембраны, а также помещать её в среду с определённым химическим составом. В этих хорошо контролируемых условиях измеряют ионные токи, проходящие через мембрану, что, в конечном итоге, позволяет делать выводы о том, как ионные каналы реагируют на электрическое и химическое воздействие. Метод настолько чувствителен, что позволяет наблюдать поведение и химические превращения единичных молекул, взаимодействующих с мембраной.O. P. Hamill, A. Marty, E. Neher, B. Sakmann, and F. J. Sigworth. Improved Patch-Clamp Techniques for High-Resolution Current Recording from Cells and Cell-Free Membrane Patches. // Pfluegers Arch (1981)391:85-100 Разработаны экспериментальные протоколы, позволяющие измерять характеристики ионных каналов оптимальным образом. Немецкие исследователи Эрвин Неер и Берт Сакман, разработавшие эту методику, получили Нобелевскую премию в 1991 году.
Задача: исследование трансмембранных ионных токов
Живые клетки покрыты мембраной, структурную основу которой составляет двойной слой липидов, слабо проницаемый для воды и практически непроницаемый для ионов. Каждая клетка должна обмениваться с внешней средой различными веществами и, в частности, ионами. Перенос ионов через мембрану играет важную роль в процессах возбуждения клетки и передачи сигналов. Ионы проникают в клетку и выходят из неё через встроенные в мембрану белковые структуры — каналы и транспортёрыФизиология человека. Под ред. В. М. Покровского, Г. Ф. Коротько. М.Медицина 2007. ISBN 5-225-04729-7
Транспортёры — это мембранные белки, которые соединяются с переносимым веществом по одну сторону мембраны, переносят это вещество через мембрану и затем его освобождают. Такой перенос становится возможным потому, что в результате соединения с веществом транспортёр меняет конформацию (то есть форму, ориентацию). Важнейший транспортёр в клетках эукариот — это натрий-калиевый насос. Для работы этого насоса требуется энергия, которую он черпает из запасённой в клетке АТФ. За один цикл своей работы насос выводит из клетки 3 иона Na+ и вводит в неё 2 иона K+. Одна молекула этого транспортёра совершает примерно 10³ циклов в секунду. Сходная частота циклов характерна и для других видов транспортёровР.Геннис. Биомембраны — Молекулярная структура и функции, стр. 336-337. «Мир» 1997. ISBN 5-03-002419-0.
Каналы — это белки, которые выполняют функцию мембранных пор, так как формируют отверстия, сквозь которые могут проходить ионы. Мембранные каналы селективны — проницаемы только для определённых веществ. Селективность обусловлена радиусом пор и распределением заряженных функциональных групп в них. Существуют каналы, селективно пропускающие ионы натрия (натриевые каналы), а также калиевые, кальциевые и хлорные каналы. Для каждого вида ионов существует не один, а довольно много видов каналов. Сквозь один канал за секунду проходит 106 — 107 ионов.
Несмотря на фундаментальные различия в механизме транспорта через каналы и транспортёры, они могут быть образованы высокогомологичными белками. Так, недавно получены данные, что мутация единственной аминокислоты в белке транспортёра двухвалентных металлов DMT1 приводит к его превращению в кальциевый канал. Кроме того, существует по крайней мере один транспортёр (хлорид-бикарбонатный обменник эритроцитов), осуществляющий 105 переносов в секунду, что очень близко к скоростям, характерным для каналов, и заставляет предположить существование у него некоего «промежуточного» между каналами и транспортёрами механизма.
Так как ионы — это электрически заряженные молекулы, при их переходе через мембранные каналы переносится и заряд, а значит, через мембрану течёт электрический ток. Этот ток можно измерить. Чем больше разность потенциалов между сторонами мембраны, тем больше ток. Проводимость (отношение тока к разности потенциалов) одиночного канала в открытом состоянии варьирует в зависимости от вида канала, от 4-5 (у CFTRLu M, Dong K, Egan ME, Giebisch GH, Boulpaep EL, Hebert SC. Mouse cystic fibrosis transmembrane conductance regulator forms cAMP-PKA-regulated apical chloride channels in cortical collecting duct. //Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Mar 30;107(13):6082-7. и ENaCAnantharam A, Palmer LG. Determination of epithelial Na+ channel subunit stoichiometry from single-channel conductances // J.Gen.Physiol. 2007, v.130, p. 55-70) до 30—50 (например, у никотин-чувствительного холинорецептораР.Геннис. Биомембраны — Молекулярная структура и функции, стр. 349. «Мир» 1997. ISBN 5-03-002419-0) пикосименсов. Это значит, что при разности потенциалов, равной 100 мВ, через канал потечёт ток в несколько пикоампер.
Методики изучения электрических свойств клеточной мембраны Один внутриклеточный электрод. Измерение разности потенциалов Электрические явления на клеточных мембранах могут измеряться с помощью острых стеклянных микроэлектродов, которые вводятся в клетку. Техника с одним внутриклеточным электродом позволяет измерять разность потенциалов при фиксированном токе. Реже при помощи этой техники можно измерить ток при фиксированном потенциале при помощи методики коммутационной фиксации потенциала. Все измерения происходят исключительно на целой клетке, таким образом изучаются электрические свойства всей клеточной мембраны.
Двухэлектродная фиксация потенциала
Тот факт, что фиксация трансмембранного потенциала позволит измерять мембранную проводимость по изменениям тока при постоянном напряжении, был впервые осознан ещё в 40-х гг. XX века, и вскоре английские исследователи Алан Ходжкин и Эндрю Хаксли (Alan Hodgkin and Andrew Huxley) начали эксперименты с двухэлектродной фиксацией потенциала (2-electrode voltage clamp).* Microelectrode techniques: The Plymouth workshop handbook. , стр.20-27 — изд. 2-е. — Cambridge, UK: Company of Biologists, 1994. — ISBN 0-948601-49-3 Суть метода состоит в следующем. В клетку вводятся два электрода, ещё один — электрод сравнения — остаётся вне клетки. Первый внутриклеточный электрод служит для измерения трансмембранной разности потенциалов (то есть разности потенциалов между ним и электродом сравнения), второй может подавать ток. Использование одного и того же острого электрода для подачи тока и измерения разности потенциалов невозможно. Дело в том, что такой электрод имеет входное электрическое сопротивление порядка 100-200 МОм, что сравнимо с сопротивлением клеточной мембраны, поэтому, если через систему "электрод-клетка" течет ток, то падение напряжения на электроде окажется соизмеримо с падением напряжения на самой мембране, при чем не существует способа выделить эти две части. Далее, специальное устройство — генератор сигнала — задаёт командный потенциал, которому должен быть равен трансмембранный потенциал. Измеренный трансмембранный потенциал подаётся на вход устройства сравнения, которое вычитает измеренный потенциал из командного и, в зависимости от величины разности, подаёт ток на токовый электрод так, чтобы скомпенсировать эту разницу. Монитор тока, в свою очередь, постоянно измеряет величину тока, которая для этого необходима. В 1940-х 50-х годах, когда работали Ходжкин и Хаксли, не существовало микроэлектродов, поэтому в качестве внутриклеточных электродов использовались тонкие проволоки. Это определило выбор объекта — гигантский аксон кальмара диаметром 1 мм, внутрь которого и вводились эти проволоки. На этом объекте методом двухэлектродной фиксации потенциала исследователи выполнили эксперименты, в которых была установлена ионная природа потенциала действия и впервые постулировано существование ионных каналов (Нобелевская премия 1963 г., поделена с Дж. Экклзом, получившим её за исследования в области синаптической передачи). Двухэлектродная фиксация потенциала применяется и в настоящее время, с использованием острых стеклянных микроэлектродов, однако даже с ними эта методика имеет существенные ограничения: два электрода могут быть введены только в весьма крупную клетку (например, ооцит лягушки).
Решение: patch-clamp, его варианты и конфигурации Гигаомный контакт
В конце семидесятых годов XX в. Эрвин Неер (E.Neher) и Берт Сакман (B.Sakmann) обнаружили, что конусообразные стеклянные пипетки с диаметром кончика 1—2 микрона могут образовывать контакты с клеточной мембраной (границе «мембрана — стекло») с сопротивлением в несколько гигаом — это так называемый гигаомный контакт. Он позволяет изолировать от внешней среды и от остальной части мембраны тот её фрагмент, который находится внутри пипетки. Отграниченный пипеткой фрагмент мембраны и называется patch — «фрагмент», слово clamp (фиксация) в названии метода можно интерпретировать и как захват и изоляцию этого фрагмента, так и как фиксацию трансмембранного потенциала в изолированном фрагменте, или, как будет описано позже, потенциала или тока на целой клетке.B. Sakmann, E. Neher. Single-channel recording. — 1995. ISBN 0-306-44870-X В пипетку, заполненную раствором электролита, помещается хлор-серебряный электрод, второй электрод размещается внеклеточно, в омывающей жидкости. Отличие электрической схемы от ранее описанной для двухэлектродной фиксации заключается в том, что один и тот же электрод используется как для измерения разности потенциалов, так и для подачи тока, что оказывается возможным благодаря сравнительно низкому сопротивлению пипетки.
На фото 1 показана часть такой установки.
Огромная сфера, часть которой видна на мониторе в центре фотографии — это клетка (ооцит лягушки Xenopus laevis), находящаяся в данный момент на предметном столике микроскопа, к ней подведена patch-пипетка, её диаметр у носика — около 3 микрон. После установления гигаомного контакта она изолирует фрагмент мембраны площадью приблизительно 7 мкм², ток от ионных каналов в этом фрагменте можно будет записывать.
Конфигурация «Cell-attached» Только что описанная конфигурация называется cell-attached patch-clamp (patch-clamp «с прикреплённой клеткой»). Она иллюстрируется схемой 2.
Эта конфигурация, однако, имеет два неудобства.
Во-первых, она не позволяет с достаточной надёжностью измерять, а, следовательно, и задавать трансмембранную разность потенциалов — поскольку оба электрода — как пипеточный, так и внешний, находятся по одну сторону мембраны. Вообще говоря, можно, используя омывающий раствор с ионной композицией, повторяющей состав цитоплазмы, деполяризовать мембрану вне пипетки, так что разность потенциалов между внешним электродом и цитоплазмой исчезнет, а тогда разность потенциалов между электродами окажется равна трансмембранному потенциалу — но все это весьма приблизительно, так как точный состав цитоплазмы нам неизвестен.
Во-вторых, эта конфигурация не позволяет контролировать состав среды вне пипетки — там остаётся цитоплазма, состав которой не вполне определён.
Впрочем, в определенной мере эта особенность конфигурации cell-attached является и достоинством: данная конфигурация позволяет работать в условиях, наиболее близких к физиологическим.
Конфигурация Inside-out Однако, если пипетку быстрым движением отвести от клетки, то «внутренний» кусочек мембраны оторвется от клетки и получится конфигурация inside-out (наружная сторона внутри), названная так потому, что внутренняя, обычно обращенная к цитоплазме, сторона мембраны окажется снаружи — в омывающем растворе, а наружная — внутри пипетки. (Схема 3.) Альтернативный метод перехода в конфигурацию inside-out заключается в следующем: из конфигурации cell-attached пипетку отводят плавно, формируя с двух сторон закрытую везикулу; затем поднимают пипетку в воздух и опускают во вторую ванночку, с внутриклеточным раствором. При переносе внешняя мембрана везикулы разрушается, в результате формируется конфигурация inside-out.