Микротом — механический инструмент, используемый для разрезания биологических образцов на очень тонкие сегменты, называемых срезами, для микроскопического исследования на оптическом или электронном микроскопе. Биологические образцы могут быть представлены различными способами. Но чаще всего эти образцы помещают в парафиновые блоки, и наиболее распространенным способом разрезания таких образцов является микротом. Самый первый вид микротомов позволял вручную разрезать свежий или фиксированный материал с помощью острой бритвы. Современные микротомы - это прецизионные инструменты, предназначенные для вырезания равномерно тонких срезов из различных материалов для проведения детального микроскопического исследования. Наиболее распространенным способом достижения этой цели является разделение тканей на блоки, залитые парафином , но для микротомии образец может быть подготовлен и другими способами. Основным инструментом, используемым при микротомии, является микротом, в который вставляется режущий инструмент.
Для световой микроскопии, где увеличение может достигать 1800, толщина среза может варьироваться от 1 до 10 микрон (тонкие срезы). Для электронной микроскопии, где возможно увеличение до 1 миллиона, толщина среза обычно составляет порядка 10 нанометров (ультратонкие срезы).
История После изобретения микроскопа, совершившего революцию в исследованиях клеток, ученым для изучения образцов приходилось нарезать препараты тонкой бритвой, но таким образом было сложно получить много заготовок с равномерными и точными срезами. Первый микротом был изобретен в 1770 году (1750-1795) и доработан шотландским часовщиком (1733-1814). Устройство управлялось вручную, и образец помещался в цилиндр, а срезы создавались из верхней части образца с помощью рукоятки.
В 1835 году Эндрю Причард разработал настольную модель, которая позволяла изолировать вибрацию, прикрепляя устройство к столу, отделяя оператора от ножа. Иногда авторство изобретения микротома приписывается анатому Вильгельму Хайсу-старшему (1865). В своей книге "Beschreibung eines Mikrotoms" (что в переводе с немецкого означает "Описание микротома") Вильгельм писал:Это устройство позволило добиться такой точности в работе, с помощью которой я могу создавать срезы, которые невозможно создать вручную. А именно, оно позволило получать целые срезы объектов в ходе исследований.
Другие источники также приписывают это изобретение чешскому физиологу Яну Евангелисту Пуркине. Несколько источников описывают модель Пуркине как первую в практическом применении. Неясность в происхождении микротома связана с тем фактом, что первые микротомы были просто режущими устройствами, а этап разработки ранних устройств практически не документирован.
В анатомическую практику микротом ввёл в 1856 году Герман ВелькерPaul Diepgen, Heinz Goerke Aschoff/Diepgen/Goerke: Kurze Übersichtstabelle zur Geschichte der Medizin. 7., neubearbeitete Auflage. Springer, Berlin/Göttingen/Heidelberg 1960. — S. 36..
В конце 1800-х годов разработка очень тонких образцов методом микротомии, а также селективное окрашивание важных клеточных компонентов или молекул позволили визуализировать детали под микроскопом.
Сегодня большинство микротомов представляют собой блок-держатель со сменным ножом, держателем для образцов и механизмом выдвижения. В большинстве устройств резка образца начинается с перемещения образца по ножу, при этом механизм подачи автоматически перемещается вперед, позволяя выполнить следующий разрез выбранной толщины. Толщина среза регулируется с помощью механизма регулировки, что позволяет осуществлять точный контроль.
Устройство микротома Микротомы состоят из трех основных частей:
Основание (корпус микротома) Держатель для ножа и сам нож Держатель для материала или ткани
В большинстве микротомов секция вырезается путем продвижения держателя образца к ножу, при этом нож жестко удерживается на месте. Режущее действие, которое может осуществляться как в вертикальной, так и в горизонтальной плоскости, связано с механизмом перемещения, так что держатель образца перемещается после каждого среза. Расстояние перемещения предварительно выбирается с помощью шкалы, установленной на корпусе микротома, и обычно составляет от 0,5 до 50 микрон на микротомах, выполняющих тонкие срезы и от 60 нм до 500 нм на устройствах для получения ультратонких срезов.
Классификация микротомов Существуют различные типы микротомов, в зависимости от технических спецификаций и от применения. Однако в предшествующей литературе не приводится никакой классификации микротомов, что затрудняет выбор подходящего микротома. Поэтому была предпринята попытка классифицировать имеющиеся в продаже микротомы в соответствии с их принципом работы.
Микротомы бывают:
Ручные Полуавтоматические Автоматические
Ручные микротомы разделяются на:
Качающиеся Ротационные Санные Замораживающие Вибрационные Ультрамикротомы Криостаты-микротомы (криотомы)
Автоматические микротомы в свою очередь могут подразделяться на:
Лазерные Компьютерные (электронные) Компьютерные ультрамикротомы
Качающийся микротом Качающийся микротом был изобретен сэром Горацием Дарвином (1851-1928), сыном Чарльза Дарвина. Микротом все еще применялся в двадцатом веке. Когда в 1885 году он был впервые разработан, компания Cambridge Scientific Instrument Company предоставила его музею науки в качестве образца новой технологии, где позже он стал частью постоянной коллекции.
Этот инструмент является одним из старейших по конструкции, относительно дешевым и предназначен исключительно для резки парафиновых блоков. Лезвие этого микротома закреплено, и образец, который необходимо нарезать для микроскопического исследования, перемещается вверх и вниз по лезвию по дуге окружности, совершая покачивающиеся движения. Микротом закреплен на столе таким образом, что срезы падают на рабочий стол, а затем помещаются на предметные стекла. Типичными образцами являются ткани человека и животных, а также растения, которые могут быть изучены гистологами в лабораториях или больницах. Однако недостатками являются его склонность смещаться во время резки из-за легкости рамы, а также трудности получения очень тонких срезов. Качающийся микротом в значительной степени был заменен более точным ротационным, хотя он вновь появляется в портативных криостатах.
Ротационный микротом
Этот микротом получил свое название из-за вращательного действия ручного колеса, которое приводит в действие изготовление среза образца. Аппараты такого типа представляют собой микротомы общего назначения для резки полутонких и тончайших срезов для световой микроскопии. Принцип действия основан на вращении маховика, который приводит в действие перемещение блока образца к жестко закрепленному ножу. Блок перемещается вверх и вниз в вертикальной плоскости по отношению к ножу и, таким образом, осуществляется срез ровных участков материала. Преимущество его в том, что он тяжелее и, следовательно, более устойчив, чем качающийся, и идеально подходит для изготовления серии срезов. На этой машине можно резать большие куски ткани, а угол среза (наклон ножа) регулируется. Поскольку в этом типе микротома используется более тяжелый и крупный нож, вероятность вибрации при резке снижается. На большинстве станков толщина среза варьируется от 0,5 мкм до 60 мкм. Толщина срезов тканей, залитых в парафин, обычно составляет от 3 до 5 мкм, в то время как толщина срезов образцов из смолы составляет от 0,5 до 1 мкм.
Санный микротом В санном микротоме образец, закрепленный на столике, перед каждым движением ножа автоматически поднимается на заданную высоту (толщину среза), а нож движется по салазкам по горизонтали. Основу корпуса санного микротома составляет станина. Это металлическая пластина, закрепленная на неподвижном основании. На верхней горизонтальной поверхности станины продольно располагаются две рельсы, по которым движется нож, закрепленный в ножевых санках. Станина массивна или фиксируется к столу, она обеспечивает устойчивость прибора при работе. Толщина среза, то есть степень подъема держателя образца, определяется микровинтом. Микровинт движется в наклонной или вертикальной плоскостях и имеет вид металлического стержня. Он связан с градуированным приспособлением, каждое деление которого соответствует продвижению зубчатого колеса на один зубчик, и продвигает держатель образца вверх на определенную величину. Шкала делений позволяет задавать необходимую толщину среза (от 1 до 30 мкм). Ножевые санки имеют скользящие по станине поверхности и зажим для ножа. На боковой поверхности ножевые санки имеют рукоятку, которая позволяет продвигать их по станине. Зажимы для ножа могут иметь различную конструкцию, но всегда необходимы для фиксации положения ножа под определенным углом к образцу.
Санный микротом можно использовать для срезов образцов, залитых в парафин, хотя он был разработан для залитых целлоидином образов.
Замораживающий микротом На замораживающем микротоме режут объекты в замороженном состоянии. С помощью такого микротома можно быстро получить срезы, не подвергая объект воздействию спиртов или фиксаторов, что позволяет избежать вымывания из срезов различных химических веществ, в том числе растворимых углеводов и липидов, что крайне важно при гистохимических исследованиях. Однако метод неприменим к очень мелким объектам, а также очень рыхлым и чувствительным тканям. Кроме того, на замораживающем микротоме трудно получить тонкие срезы, а получение непрерывной серии срезов практически невозможно.
Существует два типа замораживающих микротомов: углекислотный и с замораживающим полупроводниковым столиком. В углекислотном микротоме охлаждение объекта осуществляется жидкой углекислотой. Его столик соединяется шлангом с баллоном с CO2. Открывая вентиль, через камеру предметного столика пропускают углекислоту, где она испаряется, значительно охлаждая поверхность столика и замораживая объект. В некоторых случаях охлаждается углекислотой не только столик, но и нож.
В полупроводниковом замораживающем столике для замораживания тканевых блоков используется термоэлектрический эффект, или эффект Пельтье, заключающийся в том, что при пропускании постоянного тока через полупроводниковый элемент на одном его слое происходит поглощение тепла, а на другом — его выделение и соответственно повышение и понижение температуры. Нагревающаяся часть столика охлаждается проточной водой.
Вибрационный микротом
Первоначально предполагалось, что вибрационный микротом заменит ручной, но он был задуман как микротом, который мог бы производить высококачественные срезы свежего, незафиксированного материала животного или растительного происхождения. Этот инструмент был разработан для разрезания тканей, которые не были зафиксированы, обработаны или заморожены, и находит наибольшее применение в ферментативной гистохимии и ультраструктурной гистохимии. Название инструмента произошло от высокоскоростной вибрации, производимой лезвием безопасной бритвы, которая обеспечивает режущую способность. Амплитуда вибрации регулируется изменением электрического напряжения, подаваемого на нож. Чтобы предотвратить разрушение и разрывы тканей, мягкий материал режется при погружении в жидкость, которая также способствует рассеиванию тепла, выделяемого вибрирующей кромкой лезвия во время резки.
Ультрамикротом