Конъюгация у бактерий

Конъюга́ция (от  — соединение) — однонаправленный перенос части генетического материала (плазмид или бактериальной хромосомы) при непосредственном контакте двух бактериальных клеток. Открыт в 1946 году Джошуа Ледербергом и Эдвардом Татумом. Явление конъюгации было открыто и хорошо изучено у , но в дальнейшем конъюгация была описана у множества как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. Посредством конъюгации бактерии обмениваются генетическим материалом, поддерживая своё генетическое разнообразие.

История изучения Существование конъюгации у бактерий было показано в 1946 году Джошуа Ледербергом и Эдвардом Татумом. Они смешали два штамма кишечной палочки Escherichia coli, ауксотрофных (неспособных существовать на среде без определённого вещества) по разным веществам, инкубировали полученную культуру несколько часов в среде, содержащей все необходимые питательные вещества, и высеяли клетки на чашки с минимальной средой. Чтобы избежать искажения данных эксперимента реверсией некоторых мутаций, отвечающих за ауксотрофию, они использовали двойные и тройные ауксотрофы. Благодаря этому возможность появления клеток, не ауксотрофных по всем трём соединениям, за счёт реверсии мутаций была крайне низка. Когда на чашках появились колонии, исследователи заключили, что бактерии обменялись генами, которые восстанавливали нормальный фенотип. Однако Ледерберг и Татум не доказали, что ДНК передавалась между бактериями при непосредственном физическом контакте. Это удалось сделать в 1950 году. Он сконструировал U-образную трубку, разделённую напополам перегородкой, через которую могла проходить среда, но не бактериальные клетки. Далее Дэвис инкубировал в трубке несколько ауксотрофных штаммов, сильно перемешивая среду. После высеивания клеток на минимальную среду колоний не появилось. Таким образом, было показано, что для обмена ДНК, открытого Ледербергом и Татумом, был необходим физический контакт двух клеток. Впоследствии конъюгацию описали и у других бактерий, в том числе грамположительных, таких как Bacillus subtilis. Однако наиболее изучена конъюгация у E. coli, механизм которой детально рассматривается ниже.

Общий механизм

Под конъюгацией понимают перенос ДНК между бактериальными клетками при их непосредственном контакте. Как правило, при конъюгации передаются плазмиды, но у некоторых организмов передаваться может и хромосомная ДНК. При конъюгации имеет место однонаправленный перенос генетического материала от клетки-донора к клетке-реципиенту. Ниже рассматривается процесс конъюгации на примере E. coli, то есть у грамотрицательных бактерий; конъюгация у грамположительных бактерий рассматривается в разделе Конъюгация у других бактерий.

Образование пары В подавляющем большинстве случаев конъюгация возможна лишь тогда, когда у донорской клетки есть плазмида, содержащая гены, обеспечивающие передачу ДНК. У E. coli и других грамотрицательных бактерий физический контакт между двумя клетками обеспечивается половыми пилями — полыми белковыми структурами на поверхности клеток. Структура половых пилей сильно варьирует: пили, кодируемые F-плазмидой, длинные, тонкие и гибкие, а пили, кодируемые плазмидой RP4, — короткие, толстые и жёсткие. Пили взаимодействуют с рецепторами на поверхности клетки-реципиента, за счёт чего конъюгирующие клетки образуют пару. Механизм образования пары клеток при конъюгации очень похож на работу бактериальной системы секреции IV типа, с помощью которой некоторые патогенные бактерии доставляют токсины непосредственно в клетку организма-хозяина.

Передача ДНК Передача ДНК через контакт, образуемый пилем, начинается с того, что в специфическом участке передаваемой плазмиды, называемом (oriT), особый белок вносит одноцепочечный разрыв (). Хеликаза, кодируемая передаваемой плазмидой, расплетает плазмидную ДНК, и разрезанная цепь переносится в клетку-реципиент своим 5'-концом вперёд. Параллельно с этим её 3'-конец удлиняется, восполняя уходящую цепь в плазмиде-доноре по механизму репликации типа катящегося кольца. Одноцепочечная ДНК, перенесённая в клетку-реципиент, также достраивается до двуцепочечной. Таким образом, конъюгация является репликативным процессом и, строго говоря, передаётся не сама плазмида, а её копия.

Мобилизация К описанной выше передаче между клетками способны далеко не все плазмиды (их называют конъюгативными; например, таковой является F-плазмида E. coli). Иногда конъюгативная плазмида способствует передаче клетке-реципиенту неконъюгативной плазмиды при помощи процесса, который носит название мобилизации. В качестве примера можно рассмотреть мобилизацию неконъюгативной плазмиды . Она содержит ген mob, кодирующий специфическую нуклеазу, и сайт bom (аналогичный oriT), и белок Mob вносит одноцепочечный разрыв в плазмиду. По сути, для того, чтобы быть конъюгативной, плазмиде ColE1 недостаёт генов, которые кодировали бы аппарат переноса ДНК, поэтому она может передаваться в клетку-реципиент через аппарат передачи, кодируемый конъюгативной плазмидой. Иногда мобилизуемая плазмида может не иметь собственного гена mob, а одноцепочечный разрыв вносит в неё белок Mob близкородственной плазмиды.

Передача хромосомной ДНК В подавляющем большинстве случаев при конъюгации передаётся плазмидная ДНК. Однако у некоторых бактерий возможна передача и хромосомной ДНК. Например, фрагменты геномной ДНК могут передаваться вместе с F-плазмидой у E. coli, и похожие системы есть у других бактерий, например, Pseudomonas aeruginosa. В некоторых случаях для передачи хромосомной ДНК необходима интеграция плазмиды в геномную ДНК бактерии, так что, по сути, геномная ДНК передаётся в составе плазмиды. Однако известны случаи, когда хромосомная ДНК передаётся в свободном виде, вероятно, по механизму, аналогичному мобилизации неконъюгативных плазмид.

При передаче плазмиды в ходе конъюгации клетка-реципиент получает полную одноцепочечную версию плазмиды, однако хромосомная ДНК не передаётся целиком в силу того, что её полная передача потребовала бы значительного времени. Так, для переноса полной хромосомы у E. coli потребовалось бы 100 минут (в то время как для передачи плазмиды длиной 40 тысяч пар оснований (п. о.) требуется 1 минута). Фрагмент геномной ДНК, перенесённый в клетку-реципиент, может использоваться последней для рекомбинации.

Конъюгация у E. coli В 1952 году показал, что передача ДНК, описанная Ледербергом и Татумом, была полярна. Иными словами, в передаче участвовали клетка-донор (F+ от — «плодовитость») и клетка-реципиент (F-). Оказалось, что клетки F+-штамма содержат так называемую F-плазмиду. F-плазмида может находиться в клетке в двух состояниях: в свободном или в интегрированном в геном (эписомном).

При скрещивании F+-клеток и F--клеток клетка-донор не утрачивает свой F+-статус, но F--клетка при этом его приобретает. При таком скрещивании редко утрачивается ауксотрофия, поскольку клетка-реципиент получает лишь ДНК F-плазмиды без геномной ДНК.

Иная ситуация складывается, когда F--клетка конъюгирует с клеткой, у которой F-плазмида встроилась в геном. Такие клетки с встроенной в геном F-плазмидой называются Hfr от , поскольку при их передаче клетка-реципиент часто получает и фрагмент геномной ДНК, который использует для рекомбинации. При интеграции F-плазмиды в геном все гены, необходимые для переноса ДНК, такие как гены, кодирующие белки пилей, остаются функциональными. В начале конъюгации между Hfr-клетами и F--клеткой в сайт oriT интегрированной F-плазмиды вносится одноцепочечный разрыв, и ДНК начинает переходить в клетку-реципиент, однако в неё сначала поступает лишь фрагмент F-хромосомы, а за ней — уже геномная ДНК. Как упоминалось выше, для переноса полного генома требуется около 100 минут, поэтому бактерии-партнёры разрывают контакт раньше, чем успеет перенестись вся геномная ДНК. Поскольку реципиент редко получает полную копию F-плазмиды, он остаётся F--клеткой.

Поскольку интегрированная в геном F-плазмида представляет собой эписому, она может покинуть бактериальный геном и восстановить свой автономный статус. Однако иногда при вырезании хромосомы происходит ошибка, и она захватывает с собой небольшой фрагмент геномной ДНК. Такую плазмиду называют F'-плазмидой. Поскольку F'-плазмида по-прежнему содержит все гены, необходимые для конъюгации, она остаётся конъюгативной и может передаваться F--клетке по механизму катящегося кольца. Однако по завершении конъюгации клетка-реципиент становится частично диплоидной (мерозиготой), потому что те участки генома, которые привнесла в неё F'-плазмида, содержатся в ней теперь в двойном комплекте. Конъюгацию, которую опосредует F'-плазмида, иногда называют сексдукцией. Стоит отметить, что между гомологичными участками на F'-плазмиде и хромосоме реципиента может происходить рекомбинация. Через F'-плазмиды бактериальные гены могут быстро распространяться в популяциях.

В процессе конъюгации задействовано множество белков. Одноцепочечный разрыв в области oriT и начальное расплетание цепей ДНК производит белковый комплекс, известный как релаксосома. У E. coli половой пиль, по сути, представляет собой систему секреции IV типа. Она состоит из множества копий белков Tra, в том числе TraA, которые формируют пиль, и TraD, которые обеспечивают процесс энергией за счёт гидролиза АТФ. Некоторые белки Tra находятся в клеточной мембране, некоторые продолжаются в периплазматическое пространство и проходят через слой пептидогликана, достигая внешней мембраны и её липополисахаридного слоя.

Регуляция

F-плазмида содержит особый регуляторный участок, в состав которого входит, в частности, ген traJ. Белок TraJ положительно регулирует экспрессию других генов tra, которые необходимы для образования и функционирования половых пилей. Антисмысловая РНК и FinO образуют комплекс FinOP, который репрессирует образование белка TraJ и, таким образом, является ингибитором конъюгации. Описаны ещё 5 систем ингибирования переноса F-плазмиды и F-подобных плазмид в клетку-реципиент. Среди таких систем finW локализована в F-подобной плазмиде R455, системы finQ, finU и finV выявлены в ряде не-F-подобных плазмид, а система finC находится в многокопийном мутанте неконъюгативной плазмиды CloDF13. Все эти системы так или иначе регулируют гены tra. Сама F-плазмида тоже может ингибировать перенос других плазмид: так, она подавляет перенос плазмиды RP4 в 500—1000 раз.

Гены клетки-хозяина также могут влиять на конъюгативный перенос плазмид. Например, в геноме штамма K-12 E. coli выявлены гены sfrA и sfrB, которые регулируют некоторые гены tra. Кроме того, мутации в геномном гене fex понижают конъюгативный потенциал F-плазмиды.

Поверхностное исключение Клетка, содержащая в том или ином виде конъюгативную плазмиду, не может выступать в роли реципиента при конъюгации. Это явление получило название поверхностного исключения и впервые было описано у F-плазмиды, на которой лучше всего и изучено. Гены, которые отвечают за поверхностное исключение, обозначают Sfx. Такие гены были идентифицированы в F-плазмиде и нескольких F-подобных плазмидах, например, R100. Известно пять групп плазмид, различных по признаку поверхностного исключения. Представителями этих групп являются плазмиды F, ColB2-K98, R1, R100 и pED208 соответственно. Иногда ряд F-подобных плазмид выделяют в шестую группу по признаку Sfx. Однако, даже если плазмиды относятся к разным группам по признаку Sfx, нельзя безоговорочно говорить о поверхностном исключении и невозможности конъюгации. Показано, что в большинстве случаев поверхностная несовместимость связана с особенностями половых пилей.

Конъюгация у других бактерий