Проширен генетски код е вештачки модифициран генетски код во кој еден или повеќе специфични кодони се прераспределени да кодираат аминокиселина која не е меѓу 22-те белковинаогени аминокиселини .
Клучните предуслови за проширување на генетскиот код се:
не-природна аминокиселина за дадениот организам неискористен кодон за декодирање тРНК што го препознава неискористениот кодон и тРНК синтетаза која ја препознава само страната, специфична тРНК и само нестандардната аминокиселина.
Проширувањето на генетскиот код се врши со цел да ги дизајнира живите системи за точно определени, специфични цели и промени нивните својства различно од природниот генотип. Проширувањето на генетскиот код го збогатува репертоарот на корисни алатки достапни за науката.
Во мај 2019 година научниците создавале нова синтетичка форма на одржлив живот, нов вид на бактеријата Escherichia coli, со намалување на природниот број од 64 кодони во бактерискиот геном на 61 кодон. (елиминирајќи два од шест кодони кои кодираат за серин и еден од трите стоп-кодони) - од кои 59 користеле за кодирање на 20 аминокиселини .
Вовед Генетскиот код за сите организми, со многу мали исклучоци, е ист, така што сите живи суштества користат ист „генетски јазик“. Општо земено, воведувањето на нови, синтетски, вештачки, абиогени аминокиселини во белковините на живите клетки ја нарушува универзалноста на генетскиот јазик, што води до алтернативни форми на живот. Белковините се произведуваат благодарение на системот за транслација, кој ги декодираат пораките на РНК во низата аминокиселини. Транслацијата на генетските информации содржани во информациската РНК (иРНК) во дадена белковина е катализирана од рибозомите. Трансфер РНК (тРНК) се користи како клуч за декодирање на иРНК во полипептидот кој таа го кодира. тРНК препознава специфичен кодон во иРНК со комплементарна низа наречена антикодон на една од нејзините јамки. Секој кодон со три нуклеотиди се преведува во една од дваесетте природни аминокиселини. Постои најмалку една тРНК за кој било кодон, кои ја кодираат истата аминокиселина. Ензимот наречен аминоацил тРНК синтетаза ковалентно ја прикачува аминокиселината на соодветната тРНК. Повеќето клетки имаат различни синтетази за секоја аминокиселина (20 или повеќе синтетази). Од друга страна, некои бактерии имаат помалку од 20 синтетази и ја внесуваат „недостасуваната“ аминокиселина(и) со модификација на структурно поврзана аминокиселина со ензим на аминотрансфераза. Одликата искористена во проширувањето на генетскиот код е фактот што аминоацилна тРНК синтетазата често не го препознава антикодонот, туку друг дел од тРНК, што значи дека ако антикодонот се промени, кодирањето на таа аминокиселина би се променило во нов кодон. Во рибозомите, информациите од мРНК се преведуваат во специфична аминокиселина кога кодонот на иРНК се совпаѓа со комплементарниот антикодон на тРНК, а аминокиселината се додава на растечкиот полипептиден ланец. Кога се ослободува од рибозомот, полипептидниот ланец се витка во функционална белковина.
Со цел да се воведе нова аминокиселина во генетскиот код, потребни се неколку промени. Прво, за успешно декодирање на новата аминокиселина, кодонот на кој и е доделена не може да се користи за било која од 20-те природни аминокиселини. За ова се стоп-кодон или кодон со четири бази, кој се декодира со посебен тип на рибозоми. Второ, потребен е нов пар на тРНК и аминоацил тРНК синтетаза, кои се нарекуваат ортогонални парови, во смисла на тоа да истите ги нема во природниот фенотип на организмот. Во идеален случај, ортогоналните парови не смеат да интерагираат со било кој пар на ендогена тРНК/синтетаза, меѓутоа целиот тој систем треба да биде компатибилен со рибозомот и системот на белковинска транслација. Најчесто, активниот каталитички центар на синтетазата лабораториски се менува на таков начин да истиот е специфичен само и само за абиогената, не-стандардна амино акселина. Синтетазата исто така се модифицира за да ја интерагира само ортогоналната тРНК.
20-те белковинаогени аминокиселини кои се ендогени на организмот во кој се врши експанзија на генетискиот код се нарекуваат стандардни аминокиселини, односно природни или канонски, додека новите аминокиселини се означуваат како нестандардни аминокиселини (нсАК) или неприродни, киселини или не-канонски аминокиселини.
Нестандардни аминокиселини Првиот елемент на системот е нестандардната аминокиселина.
Покажано е дека над 71 различни нсАК се можат да се додадат во протеомот на E. coli, квасеци или цицачи. НсАК се структурно поголеми од стандардните аминокиселини. Најчесто, поради физиолошка сличност, имаат основна структура на фенилаланин која содржи различни супституенти, давајќи им различни својства. Ваквата разновидност овозможува мноштво на нови функции, како што се означување на белковини со помош на т.н. клик хемија, флуоресцентни маркери или белковинини во E. coli со еукариотски пост-транслациони модификации (на пр. фосфосерин, фосфотреонин и фосфотирозин).
Основата на проширувањето на генетскиот код е за првпат покажана од Ролф Фуртнер, кој сам, користејќи тРНК која кодира за фенилаланин и соодветната синтетаза, инкорпорирал п-јодофенилаланин во E.coli.
До сега, неприродните аминокиселини кои биле инкорпорирани во белковините содржат радиоактивни тешки изотопи со цел да се овозможат одредени кристалографски испитувања со х зраци; аминокиселини кои имаат нови електроснки и стерни својства; фото-врзувачки аминокиселини кои може да се користат за испитување на меѓубелковински интеракции in vitro или in vivo; кето, ацетилен, азид и боронатни супституенти за означување in vitro или in vivo; редокс својства за испитување и модулирање на процесот на пренос на електрони; фотоактивни својства за регулација на биолошките процеси; лиганди за метали кои може да бидат катализатори или сензори за метални јони; флуоресцентни или инфра-црвени својства за испитување на структурата и динамиката на белковините; α-хидрокси киселини и D-аминокиселини како алатки за проучување на конформацијата и интеракциите помеѓу на водородните врски; миметици на фосфорилирани аминокиселини како проби за пост-транслациски модификации.
Бидејќи се абиогени, нсАА е потребно или да се внесат егзогено или истите да бидат биосинтетизирани. Во првиот случај, нсАА најпрвин хемиски се синтетизира во нејзината оптички чиста L-форма. Потоа истата се додава во хранливиот медиумот кој овозможува раст и одржување на соодветните клетки. Во вториот случај, преку соодветни софтвери се идентификуваат соодветните ензими и истите по пат на генетски инжењеринг се внесуваат во организмот од интерес кој треба да ја биосинтетизира новата аминокиселина. На пример, создаден е сој на E. coli кој биосинтетизира p-аминофенилаланин од основни претходници истата ја декодира во својот генетски код.
Распределба на кодон Втор елемент на системот е кодон кој ја кодира новата нсАК.
Главната препрека за проширувањето на генетскиот код е тоа фактот што сите кодони кодираат за соодветните биогени аминокиселини. Генетскиот код има точно определен распоред кој покажува знаци на различни фази на еволуцијата, но во определен временски период истиот престанал да се менивуа и е речиси универзално зачуван. Во однос на честотата во која се случува, некои кодони се поретко застапени од другите. Кај многу сите организми, употребата на 3-те стоп кодони е различно распространета. Кај E. coli најреткиот е т.н. килибарен стоп-кодон (UAG). +Употреба на кодони во E. coliКодонАминокиселинаЗастапеност (%)UUUPhe (F)1.9UUCPhe (F)1.8UUALeu (L)1.0UUGLeu (L)1.1CUULeu (L)1.0CUCLeu (L)0.9CUALeu (L)0.3CUGLeu (L)5.2AUUIle (I)2.7AUCIle (I)2.7AUAIle (I)0.4AUGMet (M)2.6GUUVal (V)2.0GUCVal (V)1.4GUAVal (V)1.2GUGVal (V)2.4UCUSer (S)1.1UCCSer (S)1.0UCASer (S)0.7UCGSer (S)0.8CCUPro (P)0.7CCCPro (P)0.4CCAPro (P)0.8CCGPro (P)2.4ACUThr (T)1.2ACCThr (T)2.4ACAThr (T)0.1ACGThr (T)1.3GCUAla (A)1.8GCCAla (A)2.3GCAAla (A)0.1GCGAla (A)3.2UAUTyr (Y)1.6UACTyr (Y)1.4UAAStop0.2UAGStop0.03CAUHis (H)1.2CACHis (H)1.1CAAGln (Q)1.3CAGGln (Q)2.9AAUAsn (N)1.6AACAsn (N)2.6AAGLys (K)3.8AAALys (K)1.2GAUAsp (D)3.3GACAsp (D)2.3GAAGlu (E)4.4GAGGlu (E)1.9UGUCys (C)0.4UGCCys (C)0.6UGAStop0.1UGGTrp (W)1.4CGUArg (R)2.4CGCArg (R)2.2CGAArg (R)0.3CGGArg (R)0.5AGUSer (S)0.7AGCSer (S)1.5AGASer (S)0.2AGGSer (S)0.2GGUGly (G)2.8GGCGly (G)3.0GGCGly (G)0.7GGAGly (G)0.9
Супресија на килибарниот кодон Можноста за повторно користење на кодоните е за прв пат покажана од Normanly et al. во 1990 година, кога сој на E. coli го пропушта UAG (килибарниот) стоп-кодон . Ова беше возможно поради ретката застапеност на овој кодон и фактот дека факторот на ослободување 1 сам го катализира процесот на завшеток на транслацијата под дејство на овој кодон. Во лабораторијата на Шулц, тРНКTир/тирозил-тРНК синтетаза (TирРС) од Methanococcus jannaschii, архебактерија, била искористена за воведување на тирозин наместо стоп, стандардната функција на килибарниот кодон. Ова е овозможено поради разликите помеѓу ендогените бактериски синтази и ортогоналната археална синтетаза, кои не се препознаваат и интерагираат меѓу себе. Дополнително, групата го еволуирала ортогоналниот пар тРНК/синтетаза за да ја инкорпорира нестандардната аминокиселина О- метилтирозин. Ова било дополнително проследено со стерно поголемиот нафтилаланин и супституентот за фото-врзување бензоилфенилаланин, што ја докажало потенцијалната корисност на системот.
Килибарниот кодон е најмалку користениот кодон кај E.coli, но неговата промена и распределба со друга функционалност резултира со значително губење на нормалниот раст на бактеријата. Едно истражување, покажало дека има најмалку 83 пептиди кои се доминантно главно засегнати и зависат од неговото прескокнување во самата белковинска синтеза Дополнително, инкорпорирањето на аминокиселината која килибарниот кодон ја кодирал наместо запирање на транслацијата било нецелосно. Како последица на тоа, преку генетски инжињеринг создадени се неколку соеви со цел да се подобри растот на бактеријата, вклучително и отстранување на сите килибарни кодони од геномот. Во повеќето соеви на E. coli K-12 (т.е. <i id="mwAas">Escherichia coli</i> (молекуларна биологија)) има 321 UAG стоп-кодони. Следствено, огромни напори се вложени со цел истите да се заменат со аналогни стоп кодони. Единствениот успешен пристап до сега е од страна на групата на проф. Џорџ Чрч од Харвард, т.н. MAGE во CAGE: овие методи се потпираат на мултиплексна трансформација и последователна рекомбинација на добиените соеви во секој чекор за да се отстранат сите UAG кодони - рекомбинацијата претставувал главниот дел на запирање во првиот труд, но истиот бил надминат. Ова резултирало со сојот C321ΔA, на кој му недостасуваат сите UAG кодони и факторот на ослободување 1 (ФО1). Дополнително, овој сој бил дополнително направен „зависен“ од нсАК бисфенилаланин со еволуирање на неколку клучни ензими.
Пренамена на редок кодон кој кодира за биогени аминокиселини. Покрај килибарниот кодон, земени се предвид и кодони ретка застапеност кои кодираат за една од 20-те биогени аминокиселини. Кодонот AGG кодира за аргинин и бактериски сој бил успешно модифициран со цел да го пренамени да кодира за 6-N-алилоксикарбонил-лизин. Друг кандидат е AUA кодонот, кој е невообичаен по тоа што неговата соодветна тРНК треба да се разликува од AUG што го кодира метионинот. AUA тРНКАта има посебна база, лизидин. Делецијата на генот за оваа синтетаза( tilS ) било овозможено со замената на нативната тРНК со онаа на Mycoplasma mobile (која не содржи лизидин). Намалената способност за размножување е првиот чекор кон притисокот врз сојот да ги мутира сите AUA кодони во својот геном, овозможувајќи истите да се користат за проширување на генетскиот код.
Четири базни (квадруплетни) кодони