Gli scaffold (tradotto letteralmente in italiano: impalcatura) rappresentano la principale risorsa dell’ingegneria tissutale, la quale si occupa di ripristinare le funzionalità di tessuti e organi danneggiati. Si tratta di strutture artificiali con caratteristiche morfologiche nanometriche ingegnerizzate in modo da emulare la matrice extracellulare (ECM) al fine di ospitare e sostenere le coltivazioni cellulari e favorirne la crescita fino all’ottenimento della rigenerazione del tessuto danneggiato.
In particolare, l’obiettivo è ricreare un ambiente che agevoli attaccamento, migrazione e proliferazione delle cellule, ne guidi il comportamento e veicoli il trasporto di nutrimenti.
Inizialmente, i primi ad essere stati progettati avevano dimensioni strutturali micrometriche, ma ebbero scarso successo in quanto molto lontani dalla natura dei tessuti umani; vennero quindi presto rimpiazzati da scaffold dalla morfologia nanometrica che, grazie alle loro caratteristiche, più si avvicinano alle peculiarità dei tessuti naturali.
Attualmente, la ricerca si sta concentrando sulla messa a punto di moderne strutture in grado di riassorbirsi autonomamente man mano che il tessuto si rigenera, in modo che al termine del processo di sintesi il tessuto sia costituito unicamente da materiale biologico. La terapia risulterà quindi essere meno invasiva per il paziente, non essendo necessario un intervento chirurgico per rimuovere l’impianto.
Proprietà dello scaffold Un fattore determinante per il successo dell'ingegneria tissutale nella riparazione e sintesi di tessuti e organi risulta essere la corretta progettazione dello scaffold; dal momento che deve rimpiazzare la matrice extracellulare naturale, lo scaffold dovrà influire correttamente sulle proprietà biomeccaniche, biochimiche e biologiche del tessuto e delle cellule.
Innanzitutto, è fondamentale la biocompatibilità e la non tossicità per l’organismo ospitante; è importante, infatti, non solo che l’impianto non produca effetti indesiderati ma anche che induca la crescita e la differenziazione delle cellule al suo interno.
Lo scaffold deve poi possedere un giusto grado di permeabilità, ovvero porosità tale che interstizi e pori abbiano un'adeguata dimensione e costituiscano un reticolo percolativo che favorisca la crescita e disposizione cellulare, l'apporto di sostanze nutritive e lo smaltimento dei prodotti metabolici. Contemporaneamente però il grado di vuoto non dev’essere troppo elevato in modo da non andare ad inficiare le proprietà meccaniche. Generalmente, si ritiene che una porosità dell’ordine dell’80/90% garantisca una buona interconnessione, permettendo una rigenerazione tissutale adeguata.
Nel caso di scaffold bioriassorbibili, la velocità di degradazione deve essere compatibile con quella di formazione del nuovo tessuto, in modo tale da garantire il corretto sostegno e contemporaneamente la libera crescita;
Lo scaffold deve avere un'alta area superficiale e adeguate proprietà fisico-chimiche superficiali (ad esempio topografia, carica superficiale, adsorbimento e rilascio di proteine) tali da favorire l'adesione, la crescita, la proliferazione, la differenziazione e la migrazione cellulare grazie a corrette interazioni cellula – scaffold;
Al fine della biomimesi è fondamentale riuscire ad imprimere al tessuto sintetico proprietà meccaniche simili al tessuto naturale che si vuole rimpiazzare, in modo tale da favorire una corretta interazione con l’ambiente circostante una volta innestato in vivo; sopportando, perciò, i carichi e stress fisiologici cui sarà soggetto ed evitando l'insorgere di zone di accumulo di stress residuo all'interfaccia tra il tessuto sintetico e l'ambiente circostante che possono portare ad un degrado o una rottura accelerata del tessuto artificiale o di quelli circostanti (si pensi, ad esempio, all'innesto di protesi nel tessuto osseo).
Lo scaffold deve mantenere adeguate proprietà meccaniche per assicurare l'integrità strutturale del tessuto e l'architettura cellulare, soprattutto durante la fase di degradazione.
Influenza dei nanomateriali sulle proprietà finali Nei tessuti naturali, le cellule sono circondate da una matrice extracellulare, detta ECM, caratterizzata da una rete di nanofibre gerarchicamente organizzate. Questa particolare architettura, permettendo una perfetta interazione tra cellule ed ECM, garantisce supporto alle cellule e ne guida il comportamento.
Dal momento che uno dei fattori determinanti per il successo dello scaffold nella sintesi di tessuti artificiali è quella di ottenere proprietà analoghe a quelle del tessuto naturale che si vuole sostituire, risulta fondamentale riuscire ad emulare il più possibile la struttura dell’ECM, in modo da garantire la migliore interazione possibile tra impianto e corpo umano.
In particolare, per la progettazione biomimetica della matrice extracellulare del tessuto si deve essere in grado di riprodurre le proprietà fisiche della ECM, i segnali chimici prodotti dalle proteine e i peptidi che costituisco la costituisco e la sua topografia su scala nanometrica.
Di conseguenza, le nanotecnologie ricoprono un ruolo centrale nello sviluppo dell’ingegneria tissutale e, in particolare, nella produzione di scaffold.
È stato inoltre dimostrato che l’allineamento delle nanofibre di cui può essere composto uno scaffold influenza la disposizione e l’elongazione delle cellule colonizzatrici. Un’ingegnerizzazione in tal senso può di conseguenza guidare la crescita delle cellule in modo, ad esempio, da ottenere una particolare anisotropia.
Oltre a ciò, la combinazione tra struttura nano porosa e l’elevato rapporto tra area superficiale e volume favoriscono l’adesione, la proliferazione, la migrazione e la differenziazione delle cellule ospitate. Infatti, i moderni scaffold sono progettati in modo tale da non stimolare reazioni di rigetto da parte del paziente, ma anche che siamo in grado di partecipare attivamente al processo di rigenerazione dei tessuti.
Scaffold 2D e 3D Tipicamente gli scaffold vengono classificati in base alle dimensioni in cui avviene la crescita delle cellule.
Gli scaffold bidimensionali consistono generalmente in una superficie che presenta caratteristiche di dimensione nanometrica. Sono solitamente utilizzati per la cultura cellulare in vitro e la crescita tissutale sulla superficie di dispositivi impiantati. Questa tipologia di scaffold è molto utilizzata nell’ambito della ricerca vista la facilità di osservazione e misurazione e all’economicità di produzione.
Gli Scaffold tridimensionali sono in grado di superare le problematicità che sussistono nel caso di una crescita bidimensionale in vitro avvicinando la modalità di crescita a quella naturale dei tessuti umani.
Per mimare la composizione della ECM si utilizzano sia polimeri naturali che polimeri sintetici
I polimeri naturali come proteine e polisaccaridi, biocompatibili e bioattivi, hanno lo svantaggio che scaffold prodotti con questi materiali tendono a degradarsi velocemente in ambiente fisiologico e possiedono proprietà meccaniche scarse.
I polimeri sintetici, come PCL, PLA, PGA, PLGA e i loro copolimeri, consentono invece di produrre scaffold con proprietà meccaniche elevate, elevata stabilità dimensionale in ambiente fisiologico e velocità di degradazione regolabile. I polimeri sintetici non sono però bioattivi e quindi in grado di indirizzare il comportamento cellulare.
Viste le caratteristiche complementari di polimeri naturali e sintetici si cerca di combinarli in modo da sfruttare i vantaggi offerti da uno e l'altro tipo.
Lo scaffold consiste in entrambi i casi in un idrogel, cioè in un reticolo polimerico che intrappola al suo interno una fase continua liquida acquosa. Nel caso di scaffold bidimensionali il gel ha geometria di uno strato di spessore nanometrico. In particolare, lo scaffold bidimensionale viene prodotto realizzando uno strato in polimero sintetico e in seguito funzionalizzando la sua superficie con proteine, polisaccaridi e peptidi bioattivi in modo da renderlo in grado di regolare la risposta cellulare. Gli scaffold tridimensionali sono invece materiali bulk.
Inoltre, possono essere utilizzati nanomateriali come additivi alla matrice polimerica. Polimeri funzionali, cioè polimeri elettricamente conduttivi vengono impiegati nella riparazione di tessuti neurali e nella stimolazione dei neuroni. Nell'ingegneria osseo-tissutale si utilizza idrossiapatite sotto forma di nanoparticelle miscelate a polimeri sintetici o naturali (ad esempio collagene) in quanto imita la dimensione dei cristalli minerali nelle ossa e negli altri tessuti mineralizzati. Nanoparticelle metalliche e nanomateriali a base di carbonio e titanio trovano numerose applicazioni.
Superficie dello scaffold La superficie dello scaffold è l’elemento attraverso cui avviene l’interazione con le cellule del tessuto da rigenerare e l’ambiente dell’ospite. Risulta quindi di fondamentale importanza la biomimesi sulla superficie della ECM del tessuto al fine di favorire la crescita cellulare, l’integrazione e minimizzare la risposta immunitaria.
Nanocoatings I nanocoatings consistono in rivestimenti di spessore nanometrico depositati sulla superficie al fine di riprodurre la ECM del tessuto da rigenerare e al cui interno possono venir inseriti fattori di crescita, farmaci, nanoparticelle e agenti antibatterici. I nanocoatings possono venir utilizzati sia come substrati per la coltura cellulare 2D in vitro sia per il rivestimento della superficie di dispositivi impiantati in modo da favorirne l’integrazione.
Funzionalizzazione superficiale Con funzionalizzazione superficiale si intende la formazione di legami tra la superficie e biomolecole allo scopo di aumentare la biocompatibilità, aumentare l’adesione cellulare, guidare il comportamento cellulare, riconoscere target specifici, stimolare la differenziazione cellulare, controllare il rilascio di farmaci, ostacolare la proliferazione di batteri. Nell’ambito della produzione di scaffold si ha interesse ad ottenere una funzionalizzazione superficiale di un gran numero di strutture differenti (nanoparticelle, nanotubi, grafene…). In ogni caso la funzionalizzazione porta alla formazione di legami covalenti o all’adsorbimento delle biomolecole sulla superficie.
Pre-funzionalizzazione e funzionalizzazione della superficie di scaffold 2D Nella produzione di scaffold 2D, i polimeri sintetici utilizzati, essendo poliesteri (PCL, PLA, PGA e i loro copolimeri), non presentano catene laterali con gruppi funzionali. Devono quindi venir pre-funzionalizzati in modo da renderli reattivi prima di poter procedere alla funzionalizzazione con biomolecole.
Al fine di pre-funzionalizzare la superficie dello scaffold si può ricorrere a tecniche come ammonolisi, idrolisi e trattamento al plasma.
L’ammonolisi e l’idrolisi consistono nella rottura di legami esterici superficiali con introduzione di gruppi carbossilici e ossidrilici sulla superficie. Nel caso di trattamento al plasma, invece, il bombardamento ionico, oltre a pulire e sterilizzare la superficie, porta alla formazione di radicali che possono venir sfruttati per legare gruppi funzionali superficiali. Il trattamento al plasma ha il vantaggio di poter essere applicato con qualsiasi substrato polimerico.
La superficie può poi venir funzionalizzata:
Mediante reazione tra i gruppi funzionali presenti sulla superficie e biomolecole contendenti gruppi amminici come proteine, peptidi biomimetici e polisaccaridi. In questo caso le biomolecole risultano legate alla superficie tramite legami covalenti.
Mediante l’adsorbimento fisico sulla superficie di biomolecole. In questo caso il pretrattamento della superficie ha lo scopo di aumentare l’adsorbimento superficiale e la stabilità del coating che però risulta comunque limitata nel tempo.