A peroxidase de ravo picante (HRP polas súas siglas en inglés de horseradish peroxidase) é un encima peroxidase que se encontra nas raíces do ravo picante (Armoracia rusticana). Utilízase amplamente en aplicacións en bioquímica principalmente pola súa capacidade de amplificar un sinal feble e incrementar a detectabilidade dunha diana molecular. É un metaloencima con moitas isoformas, da cal o tipo máis estudado é o C.

Estrutura

A estrutura do encima resolveuse por primeira vez por cristalografía de raios X en 1997; e desde entón foi resolta varias veces máis con diversos substratos. É unha proteína en hélice alfa que leva unido un grupo hemo como cofactor redox.

Substratos

O encima HRP só ou conxugado é de pouco valor en bioquímica; a súa presenza debe facerse visible utilizando un substrato que, cando se oxida por acción da HRP usando peróxido de hidróxeno como axente oxidante, produce un característico cambio que é detectable por métodos espectrofotométricos.

Describíronse numerosos substratos da peroxidase de ravo picante, que foron comercializados para aproveitar as características desexables da HRP. Estes substratos poden pertencer a varias categorías. O HRP cataliza a conversión de substratos cromoxénicos (por exemplo, o TMB, DAB, ABTS) en produtos coloreados, e produce luz cando actúa sobre substratos quimioluminescentes (por exemplo a quimioluminescencia potenciada polo luminol).

miniatura|center|500px|Algúns dos substratos cromoxénicos máis comúns da HRP; o luminol é unha excepción, xa que xera un fluoróforo despois dunha reacción catalizada pola HRP en vez dun cromóforo.

Aplicacións

A peroxidase de ravo picante é unha glicoproteína de 44.173,9 daltons que ten 6 residuos de lisina que poden ser conxugados a unha molécula etiquetada. Cando se incuba cun substrato axeitado produce un derivado coloreado fluorimétrico ou derivado luminescente da molécula etiquetada, o que permite que sexa detectado e cuantificado. A HRP úsase a miúdo en conxugados (moléculas que foron enlazadas xeneticamente ou quimicamente) para determinar a presenza dunha diana molecular. Por exemplo, pode utilizarse un anticorpo conxugado á HRP para detectar unha pequena cantidade de proteínas específicas na técnica do western blot. Aquí, o anticorpo proporciona a especificidade para localizar a proteína de interese, e o encima HRP, en presenza dun substrato, produce un sinal detectable. A peroxidase de ravo picante úsase tamén comunmente en técnicas como ELISA e a inmunohistoquímica debido á súa natureza monomérica e á facilidade coa cal produce produtos coloreados.

A peroxidase de ravo picante é ideal en moitos aspectos para estas aplicacións porque é menor, máis estable e máis barata que outras alternativas correntes como a fosfatase alcalina. Tamén ten unha alta velocidade de recambio (turnover) que permite a xeración de sinais fortes nun espazo de tempo relativamene curto.

Ademais, "en anos recentes a técnica de marcar neuronas co encima peroxidase de ravo picante converteuse nunha importante ferramenta. Na súa breve historia, este método probablemente foi utilizado por máis neurobiólogos que os que utilizaron a tinguidura de Golgi desde o seu descubrimento en 1870."

Potenciación da luminescencia

A peroxidase de ravo picante cataliza a oxidación do luminol a 3-aminoftalato por medio de varios intermediarios. A reacción é acompañada pola emisión de luz de baixa intensidade a 428 nm. Porén, en presenza de certos compostos químicos, a luz emitida é potenciada ata ser 1000 veces maior, o que fai que a luz sexa doada de detectar, incrementando a sensibilidae da reacción. A potenciación da emisión de luz denomínase quimioluninescencia potenciada ou aumentada (ECL, do inglés enhanced chemiluminescence). Poden utilizarse varios potenciadores, pero os máis efectivos son fenois modificados, especialmente o p-iodofenol. A intensidade da luz é unha medida do número de moléculas de encima que están reaccionando e así da cantidade de híbrido. A quimioluminescencia potenciada establécese de forma simple e é sensible, e pode detectar uns 0,5 pg de ácido nucleico en Southern blots e northern blots. A detección por medio de substratos quimioluminescentes ten varias vantaxes sobre o uso de substratos cromoxénicos. A sensibilidade é de 10 a 100 veces maior, e a cuantificación da cantidade de luz emitida é posible nun amplo rango dinámico, mentres que cos precipita<dos coloreados é moito máis limitada, de aproximadamente unha orde de magnitude inferior. Os filtros de bandas (stripping filters) son moito máis fáciles cando se usan os substratos quimioluminescentes.

Notas

Véxase tamén Ligazóns externas

Categoría:Oxidorredutases