thumb|upright=1.4|Hemijska konverzija arginina u citrulin, poznata kao citrulinacija ili deiminacija. Citrulinacija ili deiminacija jeste konverzija aminokiseline arginina u proteinu u aminokiselinu citrulin. Citrulin nije jedna od 20 standardnih aminokiselina kodiranih DNK u genetičkom kodu. Umjesto toga, on je rezultat posttranslacijske modifikacije. Citrulinacija se razlikuje od formiranja slobodne aminokiseline citrulina kao dijela ciklusa ureje ili kao nusprodukta enzima iz porodice sintaze dušik-oksida.
Enzimi koji se nazivaju arginin-deiminaze kataliziraju deiminaciju slobodnog arginina, dok proteinske arginin-deiminaze ili peptidilarginin-deiminaze (PAD) zamjenjuju primarnu ketiminsku grupu ketonskom grupom. Arginin jeste pozitivno nabijen pri neutralnom pH, dok citrulin nema neto naboj. To povećava hidrofobnost proteina, što može dovesti do promjena u savijanju, utičući na strukturu i funkciju.
Imunski sistem može napasti citrulinirane proteine, što dovodi do autoimunskih bolesti, kao što su reumatoidni artritis i multipla skleroza. Fibrin i fibrinogen mogu biti omiljena mjesta za deiminaciju arginina unutar reumatoidnih zglobova. Testovi za prisustvo antitijela protiv citruliniziranog proteina su visoko specifični (88–96%) za reumatoidni artritis, otprilike jednako osjetljivi kao i reumatoidni faktor (70–78%) za dijagnozu RA, i mogu se otkriti čak i prije početka kliničke bolesti.
Citrulinirani vimentin može biti autoantigen kod reumatoidnog artritisa i drugih autoimunskih bolesti, te se koristi za proučavanje reumatoidnog artritisa. Štaviše, antitijela protiv mutiranog citruliniranog vimentina mogu biti korisna za praćenje učinaka terapije reumatoidnog artritisa. ELISA sistem koristi genetički modificirani citrulinirani vimentin, prirodno prisutnu izoformu vimentina, kako bi se poboljšale performanse testa.
U reakciji od arginina do citrulina, jedan od terminalnih atoma dušika argininskog bočnog lanca zamjenjuje se kisikom. Stoga se uklanja pozitivno naelektrisanje arginina (pri fiziološkom pH), mijenjajući tercijarna struktura proteina. Reakcija koristi jedanu molekulu vode i daje amonijak kao nusprodukt:
PAD podtipovi PAD-ovi se nalaze kod hordata, ali ne i kod nižih životinja. Kod sisara pronađeno je pet PAD izotipova – PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 i PAD6. Smatralo se da je PAD5 jedinstveni izotip kod ljudi; međutim, pokazalo se da je homologan PAD4. Ovi izotipovi razlikuju se u pogledu njihove tkivne i ćelijske distribucije.
Ekspresija PAD1 je otkrivena u epidermi i maternici, a djeluje u citrulinaciji keratina i filagrina, ključnih komponenti keratinocita. PAD2 eksprimira se u visokoj mjeri u centralnom nervnom sistemu, uključujući oko i mozak, kao i skeletne mišiće i slezenu. PAD transkripti pronađeni su u očima miševa C57BL6/J već 14,5. dana embrionalnog razvoja. Također pokazano je da PAD2 interreaguje sa vimentinom u skeletnim mišićima i makrofagima, uzrokujući rastavljanje filamenata, što ukazuje na ulogu u apoptozi.
Jedan od ciljnih supstrata PAD2 je mijelinski bazni protein. U normalnoj mrežnjači, deiminacija se nalazi u gotovo svim slojevima mrežnjače, uključujući fotoreceptore. Deiminacija je također zabilježena u neuronskim ćelijama, kao što su astrociti, mikroglija i oligodendrociti, Schwannove ćelije i neuroni. Metilacija i fosforilacija mijelinskog baznog proteina aktivne su tokom procesa zvanog mijelinogeneza. U ranom razvoju centralnog nervnog sistema embriona, deiminacija mijelinskog baznog proteina ima glavnu ulogu u sastavljanju mijelina. Kod odraslih, deiminacija mijelinskog baznog proteina javlja se kod demijelinizirajućih bolesti kao što je multipla skleroza. Mijelinski bazni protein može uticati na različite tipove ćelija u svakom slučaju.
Ekspresija PAD3 povezana je s modifikacijom ovčje vune. Citrulinacija trihohialina omogućava mu vezivanje i umrežavanje keratinskih filamenata, usmjeravajući rast vlakana vune.
PAD4 reguliše ekspresiju gena putem modifikacija histona. DNK je omotana oko histona, a histonski proteini mogu kontrolisati ekspresiju DNK kada se hemijske grupe dodaju i uklanjaju. Ovaj proces poznat je kao posttranslacijska obrada ili posttranslacijska modifikacija, jer se odvija na proteinu nakon što je DNK prevedena. Uloga posttranslacijske obrade u regulaciji gena je predmet rastućeg područja istraživanja, epigenetike. Jedan mehanizam modifikacije je metilacija. Metilna grupa veže se za arginin na histonskom proteinu, mijenjajući vezivanje DNK za histon i omogućavajući transkripciju. Kada PAD pretvara arginin u citrulin na histonu, blokira daljnju metilaciju histona, inhibirajući transkripciju. Glavni izotip za ovo je PAD4, koji deiminira arginine i/ili monometilirane arginine na histonima 3 i 4, isključujući efekte metilacije arginina.
Autoimunske bolesti Kod reumatoidnog artritisa i drugih autoimunskih bolesti, kao što su psorijatski artritis, sistemski eritemski lupus i Sjögrenov sindrom, autoantitijela često napadaju citrulinirane proteine. Prisustvo antitijela protiv citruliniranog proteina jeste standardni test za reumatoidni artritis i povezano je s težim oblikom bolesti. Citrulinirani proteini također se nalaze u ćelijskim ostacima koji prate uništavanje ćelija kod Alzheimerove bolesti i nakon pušenja cigareta. Dakle, čini se da je citrulinacija dio mehanizma koji stimulira imunski sistem kod autoimunskih bolesti. Međutim, citrulinirani proteini također se mogu naći u zdravoj kolonskoj mukozi.Enzyme-activating antibodies revealed as marker for most severe form of rheumatoid arthritis, Science Daily, May 22, 2013Can Smoking Trigger Autoimmunity in RA? Scientists seek to connect the dots between smoking and rheumatoid arthritis, By Debra Dreger
Detekcija citruliniranih peptida i proteina Citrulinirani peptidi i proteini mogu se detektovati korištenjem antitijela usmjerenih na citrulinirane ostatke ili detektovati korištenjem tehnologija zasnovanih na masenoj spektrometriji proteomici. Citrulinacija arginina rezultira povećanjem monoizotopske mase od +0,984016 Da, što se može izmjeriti masenom spektrometrijom. Pomak mase je blizak razlici mase između različitih izotopa peptida od +1,008665, što se može zamijeniti za citrulinirani peptid, posebno na instrumentima niske rezolucije. Međutim, ovo je manji problem sa modernim masenim spektrometrima visoke rezolucije/visoke tačnosti. Nadalje, pomak mase je identičan pomaku mase uzrokovanom deamidacijom bočnog lanca aminokiseline asparagina ili glutamina, što su uobičajene modifikacije.
Ostaci citrulina mogu se hemijski modificirati sa butandionom ili biotinilacijom prije analize, što dovodi do drugačijeg pomaka mase, a ova strategija je uspješno korištena za olakšavanje identifikacije pomoću masene spektrometrije. Drugi pristup je korištenje neutralnog gubitka izocijanske kiseline (HNCO) iz ostataka citrulina, kada se podvrgnu fragmentaciji izazvanoj disocijacijom niske energije u masenim spektrometrima. Gubitak uzrokuje pomak mase od -43,0058 Da, što maseni spektrometri mogu iskoristiti za pretežno odabir citruliniranih peptida za fragmentaciju (sekvenciranje).
Konačno, može se iskoristiti gubitak pozitivnog naboja pri fiziološkom pH uzrokovan citrulinacijom. Prije proteomske analize odozdo prema gore, proteini se enzimski cijepaju na peptide. Uobičajeno se koristi proteaza tripsin, koja se cijepa nakon pozitivno nabijenih ostataka arginina i lizina. Međutim, tripsin se ne može cijepati nakon ostatka citrulina koji je neutralan. Propušteno cijepanje nakon ostatka citrulina, zajedno s ispravnim pomakom mase, može se koristiti kao specifičan i osjetljiv marker za citrulinaciju, a strategija je kompatibilna sa standardnim radnim procesima proteomike odozdo prema gore. Prvi sveobuhvatni udžbenik o deiminaciji objavljen je 2014. godine. while the second edition was published in 2017.
Reference
Kategorija:Posttranslacijske modifikacije Kategorija:Struktura proteina