right|thumb|320px|Ciklus dušika. Nitrifikacija je biološka oksidacija amonijaka u nitrat, putem posrednika nitrita. Nitrifikacija je važan korak u ciklusu dušika u zemljištu. Proces potpune nitrifikacije može se odvijati putem odvojenih organizama ili u potpunosti unutar jednog organizma, kao kod bakterija roda Comammox. Transformacija amonijaka u nitrit je obično korak koji ograničava brzinu nitrifikacije. Nitrifikacija je aerobni proces koji izvode male grupe autotrofnih bakterija i arheja.
Mikrobiologija Oksidacija amonijaka Proces nitrifikacije počinje prvom fazom oksidacije amonijaka, gdje se amonijak (NH3) ili amonijak (NH4+) pretvara u nitrit (NO2−). Ova prva faza se ponekad naziva nitritacija. Izvode je dvije grupe organizama, bakterije koje oksidiraju amonijak (AOB) i arheje koje oksidiraju amonijak (AOA ).
Amonijak-oksidirajuće bakterije Bakterije koje oksidiraju amonijak (AOB) su obično gram-negativne bakterije i pripadaju redovima Betaproteobacteria i Gamaproteobacteria uključujući često proučavane rodove Nitrosomonas i Nitrosococcus. Poznati su po svojoj sposobnosti korištenja amonijaka kao izvora energije i rasprostranjeni su u širokom rasponu okruženja, kao što su tla, vodeni sistemi i postrojenja za prečišćavanje otpadnih voda. AOB posjeduju enzime zvane amonijak-monooksigenaze (AMO), koji su odgovorni za kataliziranje konverzije amonijaka u hidroksilamin (NH2OH), ključni međuprodukt u procesu nitrifikacije. Ova enzimska aktivnost je osjetljiva na faktore okoline, kao što su pH, temperatura i dostupnost kisika.
AOB igraju vitalnu ulogu u nitrifikaciji tla, što ih čini ključnim igračima u kruženju hranjivih tvari. Doprinose transformaciji amonijaka nastalog razgradnjom organske tvari ili gnojiva u nitrit, koji potom služi kao supstrat za bakterije koje oksidiraju nitrite (NOB).
Amonijak-oksidirajuće arheje Prije otkrića arheja sposobnih za oksidaciju amonijaka, amonijak-oksidirajuće bakterije (AOB) smatrani su jedinim organizmima sposobnim za oksidaciju amonijaka. Od njihovog otkrića u 2005., kultivisana su dva izolata AOA: Nitrosopumilus maritimus i Nitrososphaera viennensis. Kada se porede AOB i AOA, AOA dominira i u tlu i u morskom okruženju, što sugerira da razred Nitrososphaerota (ranije Thaumarchaeota) mogu više doprinositi oksidaciji amonijaka u ovim okruženjima.
Krenarheol, za koji se općenito smatra da ga proizvodi isključivo AOA (posebno Nitrososphaerota), predložen je kao biomarker za AOA i oksidaciju amonijaka. Utvrđeno je da se brojnost krenarheola prati sa sezonskim cvjetanjem AOA, što sugerira da bi moglo biti prikladno koristiti brojnost krenarheola kao zamjenu za populacije AOA. and thus ammonia oxidation more broadly. However the discovery of Nitrososphaerota that are not obligate ammonia-oxidizers complicates this conclusion, as does one study that suggests that crenarchaeol may be produced by Marine Group II Euryarchaeota.
Oksidacija nitrita Drugi korak nitrifikacije je oksidacija nitrita u nitrate. Ovaj proces se ponekad naziva nitracija. Oksidaciju nitrita provode bakterije koje oksidiraju nitrite (NOB) iz taksona Nitrospirota, Nitrospinota, Pseudomonadota i Chloroflexota. NOB su obično prisutni u tlu, geotermalnim izvorima, slatkovodnim i morskim ekosistemima.
Potpuna oksidacija amonijaka
Oksidacija amonijaka u nitrat u jednom koraku unutar jednog organizma predviđena je u 2006. i otkrivena 2015. godine kod vrste Nitrospira inopinata. Čista kultura organizma je dobijena u 2017., predstavljajući revoluciju u razumijevanju procesa nitrifikacije.
Historija Ideju da je oksidacija amonijaka u nitrat zapravo biološki proces prvi je dao Louis Pasteur 1.862. Kasnije, 1875. godine, Alexander Müller, dok je provodio procjenu kvaliteta vode iz bunara u Berlinu, primijetio je da je amonijak stabilan u steriliziranim rastvorima, ali nitrificiran u prirodnim vodama. A. Müller iznio je tezu da nitrifikaciju stoga vrše mikroorganizmi. U 1877., Jean-Jacques Schloesing i Achille Müntz, dva francuska poljoprivredna hemičara koji su radili u Parizu, eksperimentima s tekućom kanalizacijom i vještačkom matricom tla (sterilizirani pijesak s kredom u prahu) dokazali su da je nitrifikacija zaista mikrobno posredovan proces. Njihove nalaze ubrzo je (1878. godine) potvrdio Robert Warington koji je istraživao sposobnost nitrifikacije vrtnog tla u Eksperimentalnoj stanici Rothamsted u Harpendenu u Engleskoj. Robert Warington također je prvi put primijetio da je nitrifikacija proces u dva koraka u 1879. što je potvrdio John Munro u 1886. Iako se u to vrijeme vjerovalo da je dvostepena nitrifikacija podijeljena na različite životne faze ili karakterne osobine jednog mikroorganizma. Prvi čisti nitrifikator (oksidirajući amonijak) najvjerovatnije su 1890. godine izolovali Percy Frankland i Grace Frankland, dva engleska naučnika iz Škotske. Prije toga, Warington, Sergej Winogradski i Franklandovi su mogli obogatiti samo kulture nitrifikatora. Frankland i Frankland su uspjeli sistemom serijskih razrjeđenja s vrlo niskim inokulumom i dugim vremenom kultivacije koje se računa u godinama. Sergej Winogradski je iste godine (1890.) tvrdio da je izolovao čistu kulturu, ali njegova kultura je i dalje bila kokultura bakterija koje oksidiraju amonijak i nitrite. S. Winogradsky succeeded just one year later in 1891.
U stvari, tokom serijskih razrjeđivanja, amonijačni oksidatori i nitritni oksidatori su nesvjesno odvojeni, što je rezultiralo čistom kulturom sa samo sposobnošću oksidacije amonijaka. Tako su Frankland i Frankland primijetili da ove čiste kulture gube sposobnost izvođenja oba koraka. Gubitak sposobnosti oksidacije nitrita već je primijetio R. Warington. Uzgoj čistog nitritnog oksidatora dogodio se kasnije tokom 20. vijeka, međutim, nije moguće sa sigurnošću utvrditi koje su kulture bile bez kontaminanata jer svi teoretski čisti sojevi dijele istu osobinu (potrošnja nitrita, proizvodnja nitrata).
Ekologija
Oba koraka proizvode energiju koja se spaja sa sintezom ATP-a. Nitrificirajući organizmi su hemoautotrofi i koriste ugljik-dioksid kao svoj ugljik izvor za rast. Neki AOB-i posjeduju enzim, ureazu, koji katalizira konverziju molekule uree u dvije molekule amonijaka i jednu molekulu ugljikovog dioksida. Pokazalo se da Nitrosomonas europaea, kao i populacije AOB-a koji žive u tlu, asimiliraju ugljikov dioksid oslobođen reakcijom kako bi stvorili biomasu putem Calvinovog ciklusa i prikupljaju energiju oksidacijom amonijaka (drugog produkta ureaze) u nitrit. Ova karakteristika može objasniti pojačan rast AOB-a u prisustvu uree u kiselim sredinama.
U većini okruženja prisutni su organizmi koji će završiti oba koraka procesa, dajući nitrat kao konačni proizvod. Međutim, moguće je dizajnirati sisteme u kojima se formira nitrit (Sharon proces). Nitrifikacija je važna u poljoprivrednim sistemima, gdje se gnojivo često primjenjuje kao amonijak. Pretvaranje ovog amonijaka u nitrat povećava ispiranje dušika jer je nitrat rastvorljiviji u vodi od amonijaka.
Nitrifikacija također ima važnu ulogu u uklanjanju dušika iz komunalnih otpadnih voda. Konvencionalno uklanjanje je nitrifikacija, nakon čega slijedi denitracija. Trošak ovog procesa uglavnom leži u aeraciji (dovođenju kisika u reaktor) i dodavanju vanjskog izvora ugljika (npr. metanola) za denitrifikaciju.
Nitrifikacija se može dogoditi i u vodi za piće. U distributivnim sistemima gdje se hloramini koriste kao sekundarno dezinfekcijsko sredstvo, prisustvo slobodnog amonijaka može djelovati kao supstrat za mikroorganizme koji oksidiraju amonijak. Povezane reakcije mogu dovesti do iscrpljivanja rezidualnog dezinfekcijskog sredstva u sistemu. Pokazalo se da dodavanje hloritnog iona u vodu tretiranu hloraminom kontrolira nitrifikaciju.
Zajedno sa amonifikacijom, nitrifikacija formira proces mineralizacije koji se odnosi na potpunu razgradnju organskog materijala, uz oslobađanje dostupnih dušikovih spojeva. Ovo obnavlja ciklus dušika.
Nitrifikacija u morskom okruženju U morskom okruženju, dušik je često limitirajući nutrijent, tako da je ciklus dušika u okeanu od posebnog interesa. Korak nitrifikacije u ciklusu je od posebnog interesa za okean jer stvara nitrat, primarni oblik dušika odgovoran za "novu" proizvodnju. Nadalje, kako se okean obogaćuje antropogenim CO2, rezultirajuće smanjenje pH moglo bi dovesti do smanjenja stope nitrifikacije. Nitrifikacija bi potencijalno mogla postati "usko grlo" u ciklusu dušika.
Nitrifikacija, kao što je gore navedeno, formalno je proces u dva koraka; u prvom koraku amonijak se oksidira u nitrit, a u drugom koraku nitrit se oksidira u nitrat. Različiti mikrobi su odgovorni za svaki korak u morskom okruženju. Nekoliko grupa amonijak-oksidirajuće bakterije (AOB) poznato je u morskom okruženju, uključujući rodove Nitrosomonas, Nitrospira i Nitrosococcus. Sve sadrže funkcionalni gen amonijak-monooksigenaza (AMO) koji je, kao što mu i samo ime govori, odgovoran za oksidaciju amonijaka. Naknadne metagenomske studije i pristupi kultivaciji otkrili su da neki taksoni Thermoproteota (ranije Crenarchaeota) posjeduju AMO. Thermoproteota su obilne u okeanu, a neke vrste imaju 200 puta veći afinitet za amonijak od AOB, što je u suprotnosti s prethodnim vjerovanjem da su AOB prvenstveno odgovorni za nitrifikaciju u okeanu. Nadalje, iako se klasično smatra da je nitrifikacija vertikalno odvojena od primarne proizvodnje jer je oksidacija nitrata bakterijama inhibirana svjetlošću, nitrifikacija putem AOA ne izgleda inhibirana svjetlošću, što znači da se odvija u cijelom vodenom stubu, što dovodi u pitanje klasične definicije "nove" i "reciklirane" proizvodnje.
U drugom koraku, nitrit se oksidira u nitrat. U okeanima ovaj korak nije tako dobro shvaćen kao prvi, ali bakterije rodova Nitrospina i Nitrobacter, poznato je, ovaj korak provode u okeanu.
Hemija i enzimologija Nitrifikacija je proces oksidacije dušikovih spojeva (efektivno, gubitak elektrona sa atoma dušika na atome kisika), a katalizuje se postupno nizom enzima. 2NH4+ + 3O2 -> 2NO2- + 4H+ + 2H2O (Nitrosomonas, Comammox) 2NO2- + O2 -> 2NO3- (Nitrobacter, Nitrospira, Comammox) ili NH3 + O2 -> NO2- + 3H+ + 2e- NO2- + H2O -> NO3- + 2H+ + 2e- U Nitrosomonas europaea, prvi korak oksidacije (amonijak do hidroksilamina) provodi se pomoću enzima amonijak-monooksigenaza (AMO). NH3 + O2 + 2H+ -> NH2OH + H2O
Drugi korak (hidroksilamin u nitrit) kataliziraju dva enzima. hidroksilamin-oksidoreduktaza (HAO), pretvara hidroksilamin u dušik-oksid.
NH2OH -> NO + 3H+ + 3e-
Još jedan trenutno nepoznati enzim pretvara dušik-oksid u nitrit.
Treći korak (nitrit u nitrat) odvija se u zasebnom organizmu.
{nitrit} + akceptor <=> {nitrat} + reducirani\ alceptor
Faktori koji utiču na stopu nitrifikacije Uslovi zemljišta Zbog svoje inherentne mikrobne prirode, nitrifikacija u zemljištu je u velikoj mjeri podložna uslovima tla. Općenito, nitrifikacija zemljišta će se odvijati optimalnom brzinom ako uslovi za mikrobne zajednice podstiču zdrav rast i aktivnost mikroba. Uslovi zemljišta koji utiču na stopu nitrifikacije uključuju: Raspoloživost supstrata (prisustvo NH4+) Aeracija (dostupnost O2) Sadržaj vlage u zemljištu (dostupnost H2O) pH (blizu neutralnog) Temperatura
Inhibitori nitrifikacije Nitrifikacija inhibitori su hemijski spojevi koji usporavaju nitrifikaciju amonijaka, gnojiva koja sadrže amonij ili ureu, a koja se primjenjuju na zemljište kao gnojiva. Ovi inhibitori mogu pomoći u smanjenju gubitka dušika u tlu koji bi inače koristile kulture. Inhibitori nitrifikacije se široko koriste, dodajući se u otprilike 50% bezvodnog amonijaka koji se primjenjuje u jesen u saveznim državama SAD-a, poput Illinoisa. Obično su efikasni u povećanju iskorištavanja dušičnih gnojiva u usjevima u redovima, ali nivo efikasnosti zavisi od vanjskih uslova i njihove koristi se najvjerovatnije vide pri količinama dušika koje nisu optimalne.