Endotelinski receptor tip B, znan i kao ETB, je protein koji je kod ljudi kodiran genom EDNRB, koji je lociran na hromosomu 13, sekvenca 13q22.3: start 77,895,481 bp kraj 77,975.529 bp.
Arai et al. (1993) pokazali su da ljudski genom sadrži jednu kopiju gena ETRB, koji se prostire na 24 kb i sadrži sedam egzona i šest introna. Svaki intron nalazi se blizu granice pretpostavljenog transmebranskog domena u kodirajućoj regiji.
Koristeći somatske hibridne ćelijske linije čovjek/glodar, locirali su gen ETRB na ljudskom hromosomu 13.Arai, H., Nakao, K., Takaya, K., Hosoda, K., Ogawa, Y., Nakanishi, S., Imura, H. The human endothelin-B receptor gene: structural organization and chromosomal assignment. J. Biol. Chem. 268: 3463-3470, 1993. PubMed: 8429023
Aminokiselinska sekvenca
Dužina polipeptidnog lanca je 442 aminokiseline, a molekulska težina 49.644 Da.
1020304050 MQPPPSLCGRALVALVLACGLSRIWGEERGFPPDRATPLLQTAEIMTPPT KTLWPKGSNASLARSLAPAEVPKGDRTAGSPPRTISPPPCQGPIEIKETF KYINTVVSCLVFVLGIIGNSTLLRIIYKNKCMRNGPNILIASLALGDLLH IVIDIPINVYKLLAEDWPFGAEMCKLVPFIQKASVGITVLSLCALSIDRY RAVASWSRIKGIGVPKWTAVEIVLIWVVSVVLAVPEAIGFDIITMDYKGS YLRICLLHPVQKTAFMQFYKTAKDWWLFSFYFCLPLAITAFFYTLMTCEM LRKKSGMQIALNDHLKQRREVAKTVFCLVLVFALCWLPLHLSRILKLTLY NQNDPNRCELLSFLLVLDYIGINMASLNSCINPIALYLVSKRFKNCFKSC LCCWCQSFEEKQSLEEKQSCLKFKANDHGYDNFRSSNKYSSS Simboli
C: Cistein D: Asparaginska kiselina E: Glutaminska kiselina F: Fenilalanin G: Glicin H: Histidin I: Izoleucin K: Lizin L: Leucin M: Metionin N: Asparagin P: Prolin Q: Glutamin R: Arginin S: Serin T: Treonin V: Valin W: Triptofan Y: Tirozin
Kloniranje i ekspresija Endotelini pripadaju porodici moćnih vazoaktivnih peptida koji se sastoji od tri izopeptida, ET1 (EDN1), ET2 (EDN2) i ET3 (EDN3). Peptidi iz porodice endotelina vrše raznolik skup farmakoloških aktivnosti s različitim potencijama, što ukazuje na postojanje podtipova receptora ET. Takayanagi et al. (1991) opisali su dvije različite podklase ET receptora: specifične za ET1 i ET-neselektivne. Vane (1990) je preporučio da se tip specifičan za ET1 naziva ETA, a neselektivni tip ETB. Nakamuta et al. (1991) izolirali su cDNK koja kodira ljudski ETB receptor iz biblioteke cDNK izgrađene od ljudske jetre. Hepatociti imaju značajan broj ET receptora povezanih s biološkim djelovanjem, poput glikogenolize. cDNK imala je otvoreni okvir čitanja, koji kodira protein od 442 aminokiselinska ostatka, s relativnom masom od 49.643. Zaključena aminokiselinska sekvenca ljudskog ETB receptora bila je 88%, odnosno 64% identična sekvenci ETB receptora pacovskih pluća i ET1-receptora specifičnih za goveđa pluća. Ogawa et al. (1991) također su izolirali neisopeptid-selektivne ljudske endotelinske receptore iz biblioteke cDNK ljudskih posteljica. Predviđeni protein imao je 442 aminokiseline sa transmembranskom topologijom sličnom onoj kod drugih receptora vezanih za G-protein.
Elshourbagy et al. (1996.) izolirali su novu varijantu prerade endotelin-B receptora koju su nazvali ETB-SVR. Sekvenca receptora ETB-SVR identična je ETRB-u, osim za unutarćelijski C-terminalni domen. ETB-SVR receptor je eksprimiran kao iRNK od 2,7 kb u plućima, posteljici, bubrezima i skeletnim mišićima.
Funkcija Endotelinski receptor tipa B je receptor vezan za G-protein, koji aktivira sistem drugog glasnika fosfatidilinozitol-kalcija. Njegov ligand, endotelin, sastoji se od porodice od tri snažna vazoaktivna peptida: ET1, ET2 i ET3. Opisana je varijanta prerade, zvana SVR; sekvenca receptora ETB-SVR identična je ETRB-u, osim za unutarćelijsku C-terminalni domen. Dok obje varijante prerade vežu ET1, one pokazuju različite reakcije na vezivanje što sugerira da se one mogu funkcionalno razlikovati.
Elshourbagy et al. (1996) transficirali su COS ćelije ETB-SVR ili ETRB i otkrili da se oba receptora vežu za ET1. Međutim, dok su ćelije transficirane ETRB reagirale na ET1 povećanjem akumulacije inozitol-fosfata i unutarćelijskim zakiseljavanjem, transficirane ćelije ETB-SVR nisu pokazale niti jedan od ovih odgovora na ET1. Ovi podaci sugeriraju da su ETB-SVR i ETRB funkcionalno različiti, te da razlika u C-terminalnim aminokiselinskim sekvencama određuje funkcionalnu spregu.
Da bi istražili utjecaj hormonskog okruženja specifičnog za trudnoću na ekspresiju receptora ET1 i ET1 (EDNRA), Bourgeois et al. (1997) istraživali su može li mišićni sloj krvnih žila matičnih resica biti mjesto ekspresije ET1. Autori su otkrili da su, dok su i EDNRA i EDNRB prisutni u krvnim sudovima matičnih resica, ćelije glatkih mišića posteljice isključivo eksprimiraju EDNRA. Maggi et al. (2000) pokazali su da u ćelijama FNC-B4, koje su izvedene iz olfaktornog epitela ljudskog fetusa, i spolni steroidi i mirisi regulišu lučenje GnRH. Otkrili su biološku aktivnost EDN1 u ovoj neuronskoj ćeliji koja luči GnRH. In situ hibridizacija i imunohistohemija otkrili su ekspresiju gena i proteina EDN1 i njegovog konvertirajućeg enzima (ECE1) u fetusnoj olfaktornoj sluznici i ćelijama FNC-B4. Eksperimenti sa radioaktivno označenim EDN1 i EDN3 snažno su ukazali na prisustvodvije klase vezivnih mjesta, što odgovara ETA (16.500 mjesto/ćelija) i ETB receptorima (8.700 mjesto/ćelija). Funkcionalne studije koje su koristile selektivne analoge pokazale su da ove dvije klase receptora služe različitim funkcijama u ćelijama koje luče GnRH. Podtip ETA receptora posredovao je u povećanju unutarćelijske sekrecije kalcija i GnRH. Endotelin-1 inhibira aktivni transport Na-K za čak 50% u bubrežnim tubulama i drugim tkivima (Zeidel et al., 1989). Okafor i Delamere (2001) primijetili su da prisutnost niskih razina ET1 u vodenoj masi u kombinaciji s potencijalom za oslobađanje ET1 iz cilijkih procesa ukazuje na to da bi kristalna leća mogla biti izložena ET1 in vivo. Proučavali su utjecaj ET1 na aktivni transport Na-K u svinjskoj leći. Njihovi rezultati sugeriraju da je ET1 inhibirao transport Na-K aktivnog sočiva, aktiviranjem EDNRA i EDNRB. Aktivacija ET receptora također je uzrokovala povećanje koncentracije citoplazmatskog kalcija u epitelnim čelijama kultivirane leće. Čini se da oba odgovora na ET1 imaju korak tirozin-kinaze.
Regija 5-prim je složeni CpG otok, koji dovodi do četiri pojedinačna transkripta koji započinju unutar otoka. Pao et al. (2001) analizirali su vezu između metilacije i ekspresije EDNRB -a u ljudskim tkivima. Otok CpG nije metiliran u normalnom tkivu prostate i mjehura, dok je metiliran u epitelu debelog crijeva; DNK iz tumora izvedenih iz ovih tkiva često je bila hipermetilirana. Analiza 11 pojedinačnih CpG lokacija na otoku CpG pokazala je da su specifična mjesta s visokim nivoom metilacije u nekoliko tumora i ćelijskih linija raka također metilirana u normalnim tkivima, što ukazuje na to da bi ta mjesta mogla poslužiti kao žarišta za daljnju de novo metilaciju. Nizak nivo metilacije u malom regionu unutar 5-prim regiona korelirao je sa ekspresijom transkripta sa najviše 5 prim-a, dok skoro potpuna metilacija 200 do 1000 bp nizvodno od početnog mjesta transkripcije nije blokirala ekspresiju ovog transkripta. Tretman sa 5-aza-2-prim-deoksicicitidinom izazvao je transkripcijsku aktivaciju sva četiri EDNRB transkripta. Autori su zaključili da postoji diferencijalna metilacija ovisna o tkivu na EDNRB 5-prim regiji, te da hipermetilacija odmah 3-prim na početno mjesto transkripcije ne sprječava inicijaciju. Oni su dalje predložili mehanizam širenja de novo metilacije, počevši od njenih određenih žarišta.
Endotelin-1 sintetiziraju keratinociti u normalnoj koži i lokalno se oslobađaju nakon ozljede kože. Može izazvati bol svojim djelovanjem na receptore endotelina-A lokalnih nociceptora, ali slučajno proizvodi analgeziju preko endotelin-B receptora. Khodorova et al. (2003) mapirali su endogeni analgetski krug, u kojem aktivacija endotelin-B receptora inducira oslobađanje beta-endorfina iz keratinocita i aktivaciju kalijevih kanala spojenih unutar G-veza povezanih s G-proteinom (GIRK, također zvanih Kir-3), povezanih s opioidnim receptorima na nociceptorima. Ovi rezultati ukazuju na postojanje intrinzičnog mehanizma povratne sprege za kontrolu periferne boli u koži, te su uspostavili keratinocite kao skupinu opioida kojima upravlja receptor endotelina-B.
Koristeći profiliranje ekspresije gena, Iwashita et al. (2003) utvrdili su da su geni povezani s Hirschsprungovom bolešću visoko regulirani u matičnim ćelijama nervnog grebena pacova, u odnosu na RNK cijelog fetusa. Geni sa najvećom ekspresijom bili su GDNF, SOX10, GFRA1 i EDNRB. Najveća ekspresija viđena je u RET-u , za koji je utvrđeno da je neophodan za migraciju matičnih ćelija nervnog grebena u crijevima. GDNF je promovirao migraciju matičnih ćelija nervog grebena u kulturi, ali nije uticao na njihovo preživljavanje ili proliferaciju. Njihova zapažanja potvrđena su kvantitativnom RT-PCR analizom, protočnom citometrijom i funkcionalnom analizom.
Wang et al. (2006) procijenili su ekspresiju EDNRB -a u glaukomskih optičkih živaca čovjeka i prostorni odnos između EDNRB -a i astrocita. Učestalost pozitivne imunoreaktivnosti EDNRB-a bila je značajno veća u glaukomskih optičkih živaca kod ljudi u usporedbi s kontrolom prema dobi (9/16 naspram 1/10). EDNRB je kolokaliziran astrocitnim procesima i kvantitativno je bio veći u glaukomatoznim očima. Zaključili su da povećana imunoreaktivnost EDNRB-a u oboljelim optičkim živcima, i njegova povezanost s astrocitima sugerira da bi glija-endotelinski sistem mogao biti uključen u patološke mehanizme neuronske degeneracije.
Koristeći transkripcijsko profiliranje mikrodiseciranih tumorskih endotelnih ćelija iz karcinoma jajnika kod ljudi, Buckanovich et al. (2008) otkrili su da je prekomjerna ekspresija ETBR povezana s odsustvom limfocita koji infiltriraju tumor i kratkim vremenom preživljavanja pacijenata. Inhibitor ETBR -a povećao je adheziju T-ćelija za endotel in vitro, a ovaj efekt je suzbijen blokadom ICAM1 ili tretmanom sa donorima dušik-oksida. Miševi liječeni inhibitorom ETBR pokazali su povećano preusmjeravanje T-ćelija ovisnih o Icam1 na tumore. Liječenje inhibitorom ETBR -a omogućilo je odgovor tumora u inače neefikasnoj imunoterapiji bez promjene sistemskog antitumorskog imunskog odgovora. Sugerirali su da bi mješovita blokada ETAR-ETBR mogla istodobno ciljati tumorske ćelije putem ETAR-a i pojačati antitumorske imunske mehanizme putem vaskularne ETBR.
Biohemijska svojstva Kristalna struktura Shihoya et al. (2016), izvijestili su o kristalnim strukturama ljudskog endotelinskog receptora tipa B, u obliku bez liganda i u kompleksu s endogenim agonistom endotelinom-1 . Analiza struktura i mutacija otkrila je mehanizam selektivnosti izopeptida između endotelina -1 i -3. Transmembranske spirale 1, 2, 6 i 7 pomiču se i omotavaju cijeli endotelinski peptid na gotovo nepovratan način. Konformacijske promjene inducirane agonistom, šire se na jezgro receptora i sučelje za spajanje citoplazmatskog G-proteina i vjerovatno induciraju konformacijsku fleksibilnost u TM6. Poređenje sa muskarinskim receptorom M2 (CHRM2) sugerisalo je zajednički mehanizam za prijenos signala u receptorima spojenim sa proteinom klase A.
Molekulska genetika Sklonost Hirschsprungovoj bolesti 2 Puffenberger et al. (1994.) predstavili su dokaze da Hirschsprungova bolest (HSCR2), naizgled multigenski poremećaj, može u nekim slučajevima rezultirati mutacijom gena za receptor endotelina-B. EDNRB je bio kandidat-gen jer se mapirao u isto područje hromosoma 13 kao i HSCR2. Mutacija trp276-do-cys (W276C) bila je osjetljiva na dozu jer su homozigoti i heterozigoti imali 74%, odnosno 21% rizik od razvoja HSCR-a. Za sve kliničke oblike HSCR-a veća je učestalost megakolona kod muškaraca nego kod žena, a isto vrijedi i za specifičnu EDNRB mutaciju. Međutim, čini se da među menonitima najmanje pet megakolon-pacijenata nije nosilo mutaciju W276C EDNRB, prisutnu u većini pogođenih članova, što je sugeriralo postojanje još neotkrivenih gena osjetljivosti na HSCR.