W czasie jedenastu miesięcy poprzedzających wojnę Flotylla przeprowadziła osiem ćwiczeń wspólnie z jednostkami 14 Korpusu Strzeleckiego i oddziałami wojsk pogranicza, polegających przeprawianiu przez przeszkody wodne i osłonę własnych wojsk lądowych przed ewentualnymi atakami okrętów przeciwnika na przylegających do rzeki odcinkach frontu. Po wybuchu wojny flotylla zgodnie z przedwojennymi planami, w dniach 24 – 26 czerwca wysadziła desanty na rumuńskim brzegu. Przyczółek na rumuńskim brzegu Dunaju istniał do 19 lipca 1941. 19 lipca 1941 okręty flotylli zostały wycofane z delty Dunaju do Mikołajowa. Flotylla uczestniczyła w obronie Odessy. Rozformowana 21 listopada 1941. Ponownie sformowana 19 kwietnia 1944 roku na bazie Flotylli Azowskiej.
Flotylla uczestniczyła w operacjach: jasko-kiszyniowskiej – 20 VIII 1944 – 29 VIII 1944 belgradzkiej – 28 IX 1944 – 20 X 1944 budapesztańskiej – 29 XII 1944 – 13 II 1945 wiedeńskiej – 16 III 1945 – 16 IV 1945.
Flotylla została ostatecznie rozformowana w 1960 roku.
thumb|Monitor „Żeleźniakow” projektu SB-37 z Flotylli Dunajskiej thumb|Kuter pancerny projektu 1125