Aktywność toledańskiej inkwizycji ponownie wzrosła w 1501, w związku z pojawieniem w okolicach miejscowości Herrera młodej dziewczyny żydowskiego pochodzenia, która przypisywała sobie dar prorocki i pociągnęła za sobą wielu zwolenników spośród konwertytów. Zwolennicy tego ruchu traktowani byli z dużą surowością przez inkwizytorów.
Represje wobec konwertytów żydowskiego pochodzenia stanowiły główne zajęcie inkwizycji w Toledo aż do lat 20. XVI wieku, gdy zwróciła swą uwagę w kierunku kontroli prawowierności tzw. „starych chrześcijan” (Kastylijczyków). W latach 30. XVI wieku jej głównym celem byli tzw. alumbrados, czyli grupy mistyków podejrzanych o odstępstwa od ortodoksji. Od połowy stulecia przed trybunałem toledańskim zaczęli pojawiać się także domniemani sympatycy reformacji (przeważnie cudzoziemcy). Po roku 1570 aż do ok. 1610 główną grupę represjonowaną przez trybunał byli moryskowie, masowo deportowani z Grenady po powstaniu 1568 roku. W XVII i na początku XVIII wieku z kolei inkwizytorzy ścigali głównie żydowskich konwertytów pochodzących z Portugalii.
W latach 1559–1565 trybunał otrzymał stałe dochody z kanonii Toledo i Talavera de la Reina, a nieco później z prebend w Avili i Segovii.