Dwudziestolecie międzywojenne mały|Dom parafialny przy ul. Wielkiej, 1928 r.W 1931 roku w Głębokiem odbywał się Kongres Eucharystyczny, a rok wcześniej miasto odwiedził Józef Piłsudski, który modlił się w głębockiej świątyni. Po jego śmierci w 1935 roku w Głębokiem wyprawiono uroczyste egzekwie ku jego pamięci.
21 sierpnia 1934 roku do Głębokiego przyjechały Siostry Niepokalanki: s. Józefina, s. Aniela, a w następnym roku – s. Tadea Kościuszko jako przełożona. Założyły w tym mieście swą placówkę misyjną na terenie parafii Trójcy Świętej. Siostry ściśle współdziałały z proboszczem dziekanem ks. Antonim Zienkiewiczem. Ks. abp Romuald Jałbrzykowski stwierdził, iż parafia ta jest „jedną z pierwszych nie tylko na Kresach”. Jeszcze jeden dowód na to stanowi przyznanie s. Tadei Srebrnego Krzyża Zasługi za pracę na polu społecznym i kulturalno-oświatowym. S. Tadea zmarła 25 czerwca 1946 r. i została pogrzebana na głębockim cmentarzu.
Okres powojenny Kościół został poważnie uszkodzony w 1944 r. w czasie zdobywania miasta przez Armię Czerwoną i odbudowany do 1946 r. przez ks. A. Zienkiewicza.