Siły najeźdźców szacowano na 40–60 tysięcy żołnierzy. Twierdzy broniło około 4700 ludzi w tym: 2100 piechoty, 200 rajtarów, 1400 szlachty i 1000 mieszczan pod dowództwem kasztelana elbląskiego Ludwika Wejhera i margrabiego Władysława Myszkowskiego. W mieście schroniło się wielu uciekinierów z okolicznych wsi i miasteczek, a nawet z Rusi, Podola i Wołynia. Podczas oblężenia uwidoczniła się wada konstrukcyjna twierdzy. Kozacy przekopali groblę szczebrzeską i spuścili wodę ze stawu, odsłaniając południową część fortyfikacji. Zmusiło to obrońców do skoncentrowania na tym odcinku dużych sił. Bohdan Zenobi Chmielnicki nie dysponował artylerią oblężniczą pozwalającą na zdobycie Zamościa szturmem, poza tym zbliżała się zima, do której oblegający nie byli przygotowani. Natomiast obrońcy, wśród których szerzyła się epidemia, nie mogli liczyć na odsiecz. Nie posiadali także dostatecznej ilości żywności niezbędnej do wykarmienia załogi i ludności, która szukała schronienia za murami twierdzy.