W niepodległej Polsce Po odzyskaniu niepodległości przez Polskę większość prawosławnych obiektów sakralnych w Białymstoku została uznana za symbole polityki rusyfikacyjnej i zrewindykowana na rzecz Kościoła katolickiego.
11 lipca 1936 do Białegostoku przywieziono Poczajowską Ikonę Matki Bożej; w odprawionym przed nią nabożeństwie w cerkwi św. Mikołaja brało udział półtora tysiąca osób. Dwa lata później w obiekcie obchodzono 950. rocznicę chrztu Rusi.
Do 1951 cerkiew św. Mikołaja w Białymstoku była zwykłą świątynią parafialną. 7 września 1951, gdy Sobór Biskupów Polskiego Autokefalicznego Kościoła Prawosławnego erygował diecezję białostocko-gdańską, otrzymała status soboru katedralnego. W latach 1955–1958 obiekt został wyremontowany i zmodernizowany. Odnowiono wówczas ściany zewnętrzne i prezbiterium, zaś w podziemiach soboru urządzono cerkiew św. Serafina z Sarowa. W pierwszych latach po II wojnie światowej UB prowadziło inwigilację duchowieństwa służącego w soborze w ramach sprawy obiektowej o kryptonimie MikołajK. Sychowicz, Władza ludowa a Kościół prawosławny w województwie białostockim 1944–1956 [w:] red. J. J. Milewski, A. Pyżewska, Stosunki polsko-białoruskie w województwie białostockim w latach 1944–1956, Warszawa 2005, Instytut Pamięci Narodowej, , s. 128.. Od 1975 do 1976 odnawiano ściany wewnętrzne cerkwi.