Od momentu przeniesienia siedziby seminarium do Wilna stanowisko jego rektora było łączone z funkcją przełożonego tegoż klasztoru. Szkoła przyjęła nazwę Litewskiego Seminarium Duchownego.
Seminarium wileńskie w 1860 wprowadziło w życie postanowienia ogólnej reformy szkolnictwa teologicznego w Rosji opracowanej przez Świątobliwy Synod Rządzący. Odtąd było podporządkowane biskupowi eparchialnemu (w tym wypadku wileńskiemu i litewskiemu), który potwierdzał przedstawione przez rektora kandydatury na wykładowców. Seminarium było szkołą sześcioklasową, osoby ubiegające się o przyjęcie do niego musiały ukończyć wcześniej czteroklasową szkołę duchowną. Po reformie z programu nauczania usunięto patrystykę, archeologię cerkiewną, polemikę teologiczną, zasady gospodarowania na wsi, elementy medycyny. Nowy program zakładał skupienie się na nauce teologii i uzyskanie specjalizacji w jej obrębie. Kolejna reforma programowa miała miejsce w 1884. Seminaria poddano wówczas jeszcze ściślejszej kontroli biskupów, ograniczono nauczanie przedmiotów ogólnokształcących i języków obcych (te ostatnie były wykładane jedynie chętnym, za dodatkową opłatą) na rzecz poszerzonego kursu prawa kanonicznego. Słuchaczami seminarium wileńskiego w zdecydowanej większości byli synowie prawosławnych duchownych.