Szczególnym kultem otaczana była w nim uważana za cudotwórczą Supraska Ikona Matki Bożej.
Po zawarciu unii brzeskiej mnisi monasteru na czele z archimandrytą Hilarionem odmówili przyjęcia jej postanowień. Konflikt o przynależność jurysdykcyjną klasztoru trwał przez kilka dziesięcioleci. Ostatecznie dzięki wsparciu ktitorów monasteru i króla Zygmunta III Wazy monaster w 1635 ostatecznie przeszedł w ręce unitów i do 1824 był administrowany przez bazylianów. Zakon ten w znaczący sposób rozbudował kompleks budynków, zaś z inicjatywy unickiego metropolity kijowskiego Cypriana Żochowskiego rozpoczął w Supraślu działalność wydawniczą. W drukarni supraskiej powstała większość ksiąg liturgicznych na potrzeby Kościoła unickiego w Rzeczypospolitej, od XVIII w. drukowano w niej również dzieła świeckie.
Po znalezieniu się Supraśla pod zaborem rosyjskim, w 1824, klasztor został przejęty przez Rosyjski Kościół Prawosławny. Prawosławny męski monaster funkcjonował do 1915, gdy mnisi udali się na bieżeństwo. W okresie międzywojennym zabudowania klasztoru należały do salezjanów. W 1944 wycofujący się Niemcy wysadzili w powietrze główną cerkiew monasterską. Po wojnie w obiektach klasztornych działała szkoła rolnicza, od lat 80.