Zalążkiem przyszłej biblioteki publicznej w Wenecji stał się zbiór ksiąg ofiarowanych przez kardynała Giovanniego Bessariona, który w dniu 31 maja 1468 r. dokonał uroczystej donacji na rzecz Republiki Weneckiej "ad communem hominum utilitatem" (łac. "na powszechny ludzi użytek"); zbiór Bessariona był jedną z większych kolekcji swoich czasów i składał się z 746 kodeksów, spośród których 482 kodeksy spisane były po grecku i 246 po łacinie, do których po śmierci donatora dołączyło kolejne 250 manuskryptów.

Biblioteka zwiększała swój zasób dzięki licznym donacjom i zapisom testamentowym, jak również dzięki włączaniu całych kolekcji innych bibliotek Wenecji i Najjaśniejszej Republiki. Wiele z ofiarowanych kodeksów pochodziło z Bizancjum, zdobytego w 1453 r. przez siły osmańskie. Także dzięki temu Wenecja stała się czołowym ośrodkiem studiów nad klasykami greckimi, przyciągając licznych humanistów, spośród których wielu było skupionych wokół wydawcy Alda Manunzia w Akademii Aldyńskiej.