spotkanie obserwuje z ukrycia zakochany w królowej paź Smeton. Kiedy do komnat Anny wkracza król, Smeton usiłuje bronić czci królowej, ale król odkrywa przy nim jej portret, który uznaje za dowód zdrady. Anna, Rochefort, Percy i Smeton zostają aresztowani. Akt II Joanna Seymour odwiedza Annę uwięzioną w swoich komnatach i namawia ją do przyznania się do winy dla uratowania życia. Anna przeklina swoją rywalkę, nie wiedząc, że jest nią właśnie Joanna; wstrząśnięta tym Seymour przyznaje się do uczuć łączących ją z królem. Królowa obciąża całą winą Henryka, a jej wspaniałomyślność wprawia Joannę w głęboką rozpacz.
W toczącym się procesie o zdradę stanu Smeton obciąża Annę. Percy próbuje ratować królową, twierdząc, że zawarł z nią potajemne małżeństwo jeszcze przed jej ślubem z królem, lecz pogarsza tym tylko sytuację oskarżonych i królewskiej córki Elżbiety, która traci prawo sukcesji jako bękart. Nie pomagają błagania Joanny Seymour – królowa zostaje skazana na śmierć wraz z Percym, Rochefortem i Smetonem. W Tower Anna wybacza współoskarżonym, którzy przyczynili się do wydania na nią wyroku, przeklinając równocześnie Henryka i Joannę. W czasie gdy dwór świętuje zaręczyny króla, skazańcy zostają odprowadzeni na szafot.