Użycie bojowe Chociaż Po-2 był od początku wojny (jako samolot bojowy) maszyną całkowicie przestarzałą, to wykorzystywano go bardzo intensywnie do nękających ataków na cele naziemne i jako samolot transportowy. Walczący na froncie wschodnim żołnierze Wehrmachtu przezwali go, od charakterystycznego odgłosu silnika maszyną do szycia (niem. Nähmaschine). pierwsze użycie bojowe Po-2 miało miejsce w sierpniu 1941 w rejonie jeziora Ilmen.
Najsłynniejszą jednostką wykorzystującą samoloty Po-2 był 588. Pułk Bombowców Nocnych, w którego skład (zarówno personel naziemny jak i latający) wchodziły same kobiety. W innych pułkach nocnych bombowców kobiety stanowiły większość w składach załóg. Zadaniem pułku było nocne nękające bombardowanie znajdujących się na tyłach wroga instalacji militarnych. Dwie najbardziej utytułowane pilotki, Jekatierina Riabowa i Nadieżda Popowa, wykonały jednej nocy rekordową liczbę 18 misji bombowych. Skutkiem działań kobiecej jednostki były nie tylko straty materialne, ale także obniżenie morale żołnierzy niemieckich, którzy nazywali pilotki nocnymi wiedźmami (niem. Nachthexen, ros. Ночные Ведьмы). Efekt psychologiczny nocnych działań potęgowała również taktyka nalotów.