Gracz spotka na swojej drodze nowe postaci, z których wiele nazwisk znanych jest z kart historii. Są to m.in. Sulejman Wspaniały, Bajazyd II, Şehzade Ahmed, Manuel Paleolog. Jedną z postaci fikcyjnych jest Sofia Sartor, właścicielka księgarni w Konstantynopolu. Inspiracją dla stworzenia tej postaci był obraz Albrechta Dürera Portret młodej Wenecjanki. Sofia i Ezio zbliżą się do siebie, jednak Ezio czuje opory przed miłością i boi się wyjawić Sofii prawdę o sobie. Kolejną postacią jest Yusuf Tazim, mistrz asasynów kierujący bractwem w Konstantynopolu.
W czasach współczesnych gracz wciela się w Desmonda, który zapadł w śpiączkę. Po zakończeniu Brotherhood bohater został ponownie podłączony do Animusa. Desmond próbuje odzyskać swoją świadomość, co prowadzi do odkrycia tylnych drzwi urządzenia, które pozwalają na manipulowanie wspomnieniami, a także umożliwiają przeżywanie własnych wspomnień. Gracz kieruje Desmondem w abstrakcyjnych poziomach złożonych z łamigłówek, które są skonstruowane z jego własnych przeżyć.