W 1901 roku Różanystok wraz z całym kompleksem klasztornym przekazano mniszkom prawosławnym z Grodna. Wówczas zrealizowano najwięcej inwestycji, ale też dokonano największych dewastacji w kościele. Zburzono dwa boczne ołtarze: św. Jacka oraz świętych Apostołów Piotra i Pawła, zniszczono organy i dzwony. Wtedy też powstała tzw. cerkiew zimowa, klasztor (tzw. Drapieżnik) i inne zabudowania. W sierpniu 1915 roku, wobec nadciągających wojsk niemieckich, mniszki ewakuując się z Różanegostoku, zabrały ze sobą słynący łaskami obraz Matki Boskiej. W trakcie działań wojennych klasztor zamieniono na koszary, kościół służył za magazyn. Bezpośrednio po wkroczeniu Niemców katolicy rozpoczęli starania o odzyskanie kościoła, ale przekazano im go dopiero pod koniec okupacji.