Drugi lot kosmiczny (1–19 czerwca 1970) odbył w charakterze dowódcy statku kosmicznego Sojuz 9, wspólnie z Witalijem Siewastjanowem. Lot trwał 17 dni 16 godzin i 58 minut i był to najdłuższy lot kosmiczny do końca 1970 roku. Trudności w adaptacji organizmów kosmonautów do warunków ziemskich po długotrwałym pobycie w kosmosie, które wówczas się ujawniły, zostały nazwane w radzieckiej literaturze medycznej „efektem Nikołajewa”.
Nikołajew był także dublerem dowódców statków kosmicznych Wostok 2 oraz Sojuz 8. Od 1963 (funkcję objął po Juriju Gagarinie) do 1968 był dowódcą oddziału kosmonautów. W 1968 ukończył Akademię Techniczną Sił Powietrznych im. N. Żukowskiego, uzyskując tytuł inżyniera. W latach 1968–1992 był zastępcą naczelnika centrum szkolenia kosmonautów. Awansował na stopień generała majora lotnictwa.
Przez 18 lat (od 3 listopada 1963) był mężem kosmonautki Walentiny Tierieszkowej, z którą miał córkę Jelenę (ur. 1964). Małżonkowie rozwiedli się w 1982 roku.